兔抗γ-H2AX免疫组化抗体亲和纯化，FFPE组织+细胞双平台验证

在DNA损伤应答研究中，组蛋白H2AX的丝氨酸139位点磷酸化（即γ-H2AX）被公认为DNA双链断裂（DSB）的敏感标志物。磷酸化后的H2AX在损伤位点迅速聚集，形成肉眼可见的核焦点，为DNA损伤程度评估、药物基因毒性筛选及放射生物学研究提供了关键工具。本文所介绍的由艾美捷Bethyl Laboratories推出的抗 gamma-H2AX（磷酸化 S139）兔多克隆抗体（产品编号 IHC-00059）经亲和纯化，可特异性识别人及小鼠来源的磷酸化组蛋白H2AX，适用于福尔马林固定石蜡包埋组织及甲醛固定细胞的免疫组化检测。以下从靶点特性、抗体规格、免疫组化（IHC/ICC）操作要点及性能特征等方面进行技术说明。

一、靶点蛋白与免疫原设计

本抗体靶向的gamma-H2AX（基因符号：H2AFX，UniProt ID：P16104）是组蛋白H2A家族成员之一。H2AX在染色质中与H2A、H2B、H3、H4共同构成核小体核心结构，但在其C末端含有一个独特的保守基序（SQEY）。当DNA发生双链断裂时，PIKK家族激酶（如ATM、ATR、DNA-PKcs）磷酸化H2AX的丝氨酸139（对应Swiss-Prot P16104编号），生成γ-H2AX。

免疫原信息：本抗体采用针对人组蛋白H2AX中围绕磷酸化丝氨酸139的合成肽段作为免疫原。该表位与未磷酸化的H2AX无交叉反应，亦不识别其他H2A家族成员（如H2A.1、H2A.2）。通过抗原亲和纯化（使用固定在固相载体上的特异性表位肽段），从兔抗血清中纯化出高特异性的IgG抗体。最终抗体形态为全分子IgG，未偶联标记，浓度为100 μg/ml。

种属反应性：已验证可识别人（Human）和小鼠（Mouse）来源的γ-H2AX。这得益于磷酸化S139表位在哺乳动物中的高度保守性，因此该抗体也推荐用于大鼠等其他模式生物（需自行验证）。

二、抗体规格与储存条件

项目 | 具体参数

抗体名称 | IHC-00059

靶标 | gamma-H2AX（phospho S139）

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 全分子IgG

亚型 | IgG

标记 | 未偶联（Unconjugated）

纯度 | 抗原亲和纯化

浓度 | 100 μg/ml

缓冲液 | Tris-缓冲盐水，含0.1% BSA及0.09%叠氮钠

储存条件 | 2-8°C

有效期 | 收货后1年

储存注意事项：抗体溶液含叠氮钠作为防腐剂，可2-8°C冷藏，请勿冷冻。反复冻融会导致蛋白聚集和活性下降。如需长期保存，建议分装成单次使用量并置于-80°C（但原厂有效期1年是在2-8°C条件下验证，冷冻可能改变抗体浓度分布，推荐按说明冷藏）。叠氮钠会抑制过氧化物酶活性，如果后续计划与HRP标记二抗联用，需在染色前充分洗脱（不影响常规IHC二抗体系）。

三、应用方法与实验条件推荐

本抗体专用于免疫组织化学及免疫细胞化学，已验证的推荐稀释度和前处理要求如下。

1. 福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）

稀释范围：1:100 – 1:500（建议起始稀释1:200）

抗原修复：强烈推荐使用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0） 进行热诱导表位修复（HIER）。可采用微波炉（高火10分钟）、高压锅（2-3分钟）或水浴锅（95°C，20分钟）方式。修复后自然冷却至室温再进行封闭。

染色流程：常规脱蜡水化后，3% H?O?阻断内源性过氧化物酶（10分钟）；5%正常山羊血清封闭；一抗4°C孵育过夜或室温2小时；相应HRP标记二抗；DAB显色；苏木精复染。

阳性对照：推荐使用经电离辐射（如2-10 Gy X射线）或化疗药物（如依托泊苷、喜树碱）处理的扁桃体、睾丸或脾脏组织切片。DNA损伤诱导后30分钟可见明显核焦点。

2. 甲醛固定细胞（ICC）

稀释范围：1:100 – 1:500

固定与通透：4%多聚甲醛固定15分钟；0.3% Triton X-100通透10分钟。

抗原修复：虽然细胞爬片通透性较好，但仍推荐进行柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）热修复（于微波炉中低火加热5-10分钟），以充分暴露磷酸化表位。若不修复，信号可能较弱。

阳性对照：使用经50 μM依托泊苷处理1小时的HeLa细胞或经辐照的NIH/3T3细胞。

3. 未验证的应用

本抗体尚未验证用于Western Blot（WB）或流式细胞术（Flow）。如需WB检测γ-H2AX，建议选择特异性针对该磷酸化位点的单克隆抗体（如克隆2F3、JBW301）或已验证WB的多克隆抗体。IHC-00059仅推荐用于IHC和ICC。

四、性能特征与特异性验证

1. 表位特异性  

经抗原亲和纯化后，抗体仅识别磷酸化S139的H2AX。与未修饰的H2AX无交叉反应，也不识别其他组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）或非磷酸化的H2AX突变体。这通过ELISA和肽段竞争实验得到验证：过量磷酸化肽段可完全阻断染色信号，而非磷酸化肽段无阻断效果。

2. 灵敏度  

在推荐的稀释倍数下（1:200），可检测到低至单个DNA双链断裂诱导的γ-H2AX焦点。在组织切片中，该抗体呈现清晰的核染色（点状或弥散状，取决于损伤程度）。背景控制良好，无非特异性核或胞浆染色。

3. 批次稳定性  

每批次抗体均经过FFPE组织和辐射处理细胞的IHC质控，确保批间一致性。抗体在2-8°C储存1年内，染色强度无明显下降。