兔抗53BP1免疫组化抗体亲和纯化，跨物种识别人/小鼠组织，使用FFPE及冰冻切片

本文提供由艾美捷Bethyl Laboratories推出的靶向人及小鼠53BP1（p53结合蛋白1）的兔源多克隆抗体（货号IHC-00001）的完整技术参数，并重点针对免疫组织化学（IHC）应用提供标准化操作流程与优化建议。该抗体适用于DNA双链断裂修复、基因组稳定性及肿瘤相关研究中的组织样本检测。

一、产品基本特性

该抗体为兔多克隆抗体，以全IgG形式提供，未经标记。其特异性靶点为53BP1（TP53BP1，p53结合蛋白1），同时识别人和小鼠样本，适用于跨物种的组织切片分析。

抗体经抗原亲和纯化处理：采用固相载体上固定的53BP1特异性表位进行吸附洗脱，有效去除血清非特异性IgG，确保IHC染色低背景。免疫原对应人53BP1蛋白第350至400位氨基酸区域（参考序列NP_005648.1，基因ID 7158）。该表位位于蛋白N端区域，避开了C端的BRCT结构域和Tudor结构域，保证了特异性识别。

抗体浓度标定为100 ?g/ml（采用比尔定律，1 mg/ml IgG在280 nm处吸光度为1.4），适用于IHC应用，建议稀释后使用。

二、储存与缓冲体系

储存条件：2 – 8°C冷藏，严禁冷冻。反复冻融会导致抗体变性聚集，显著降低染色效价。

有效期：收货之日起1年。未开封且严格避光、避免温度波动的情况下可维持完整活性。

缓冲液组成：Tris缓冲盐水，含0.1% BSA（牛血清白蛋白）作为稳定蛋白，以及0.09%叠氮钠作为防腐抗菌剂。

注意事项：叠氮钠会抑制HRP活性。若后续使用HRP标记的二抗检测系统，需通过充分洗涤（至少3次PBS）去除叠氮钠残留。对于荧光检测系统，叠氮钠无显著干扰。

三、推荐应用：免疫组织化学 (IHC)

该抗体专为IHC应用开发和验证，适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片及冰冻切片。

1. 工作稀释范围

稀释度：1:100 – 1:500

起始建议：从1:100开始，根据信号强度和背景情况可进一步稀释至1:200或1:500。说明书提示“In some cases, the antibody may be diluted further than indicated”，意味着在优化后可尝试更高稀释度（如1:800）。

2. 抗原修复（必需）

Epitope exposure is recommended – 强烈推荐进行抗原修复。

推荐方法：柠檬酸盐缓冲液（Citrate buffer, pH 6.0）热诱导修复。

具体操作：将切片置于柠檬酸盐修复液中，微波炉高火加热至沸腾后转中低火维持10–15分钟；或使用高压锅修复2–3分钟。

效果说明：说明书明确指出“Epitope exposure with citrate buffer will enhance staining”，使用柠檬酸缓冲液可显著增强染色信号。

替代方法：如柠檬酸修复效果不理想，可尝试EDTA缓冲液（pH 8.0或9.0），但可能增加背景。

注意事项：修复后让切片自然冷却至室温（约20分钟），避免快速降温导致组织脱落。

3. 冰冻切片适用性

Likely to work with frozen sections – 该抗体很可能适用于冰冻切片。对于冰冻组织（OCT包埋，未经固定或轻度固定），抗原修复步骤可简化或省略（改用丙酮固定后PBS洗涤即可）。建议对冰冻切片进行预实验验证。

4. 详细IHC操作流程

试剂准备

一抗稀释液：建议使用含1% BSA和0.1% Triton X-100的PBS。

封闭液：5%正常血清（来源与二抗宿主匹配，如山羊抗兔二抗则用正常山羊血清）+ 1% BSA。

检测系统：推荐使用HRP聚合物检测系统（如EnVision+）或生物素-链霉亲和素系统，配合DAB显色。

步骤

1. 脱蜡与水化（仅FFPE切片）：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟 → 梯度乙醇（100%、95%、70%各5分钟）→ 蒸馏水洗。

2. 抗原修复：将切片浸入柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0），微波热修复（方法见上）→ 自然冷却 → PBS洗涤3次×5分钟。

3. 内源性过氧化物酶灭活（若使用HRP检测）：3% H?O?甲醇溶液室温孵育10分钟 → PBS洗涤3次×5分钟。

4. 封闭：滴加封闭液，室温湿盒内孵育30分钟。无需洗涤。

5. 一抗孵育：甩去封闭液，滴加用稀释液配制的53BP1抗体（1:100–1:500），4°C湿盒内过夜（或37°C孵育1–2小时）。过夜孵育通常能获得更强信号。

6. 洗涤：PBS-T（含0.1% Tween-20）洗涤3次×5分钟。

7. 二抗孵育：滴加HRP标记的羊抗兔二抗（推荐使用聚合HRP二抗以提高灵敏度），室温孵育30–60分钟。

8. 洗涤：PBS-T洗涤3次×5分钟。

9. 显色：新鲜配制DAB底物液，滴加至切片，显微镜下控制显色时间（通常1–10分钟，出现棕黄色阳性信号即终止）。

10. 复染：苏木精复染30秒–1分钟 → 自来水蓝化 → 梯度乙醇脱水 → 二甲苯透明 → 中性树胶封片。

四、质控与储存注意事项

生产国家：美国  

纯化工艺：表位特异性亲和纯化，确保IHC染色的特异性。  

质量控制建议：每批新抗体建议使用已知阳性组织（如人扁桃体）进行染色验证，并设置以下对照：

阴性对照：同型兔IgG替代一抗。

空白对照：省略一抗，仅用二抗。

分装建议：由于浓度较低（100 ?g/ml）且不宜冷冻，建议按单次实验用量分装至微量离心管中，避免反复开盖导致污染或效价下降，所有分装管仍应储存于2–8°C，切勿冷冻。