兔抗Myc标签抗体亲和纯化，通用检测工具，加速蛋白表达与互作研究

本文提供由艾美捷Bethyl Laboratories推出的识别c-Myc表位标签（氨基酸序列EQKLISEEDL）的兔源多克隆抗体（货号：A190-105A）的完整技术参数与标准化操作流程。该抗体适用于Western Blot、免疫沉淀、免疫细胞化学及ELISA等多种检测平台，用于检测N端或C端携带Myc标签的重组蛋白表达。

一、产品基本特性

该抗体为兔多克隆抗体，以全IgG形式提供，未经标记。其特异性靶点为Myc标签（人c-Myc蛋白第410–419位氨基酸，序列：EQKLISEEDL）。该标签广泛用于重组蛋白工程，可融合于目的蛋白的N端或C端。

抗体通过抗原亲和纯化获得：将合成肽段（Myc序列与KLH偶联）免疫兔子后，采用固相固定化的Myc肽段进行亲和层析，特异性分离抗Myc抗体。该工艺确保抗体仅识别Myc标签序列，不与天然蛋白中的其他表位发生交叉反应。

抗体浓度标定为1 mg/ml（比尔定律，A280法）。高浓度便于灵活稀释，适配多种应用需求。

二、储存与缓冲体系

储存条件：2 – 8°C冷藏，严禁冷冻。反复冻融会导致抗体变性聚合，降低效价。

有效期：收货之日起1年。未开封且严格避光保存可维持完整活性。

缓冲液组成：磷酸盐缓冲液（PBS），含0.09%叠氮钠作为防腐抗菌剂。

注意事项：叠氮钠会抑制HRP活性。若后续使用HRP标记二抗进行WB或ELISA，必须通过充分洗涤（3–5次，每次5分钟）去除叠氮钠残留；或选用不含叠氮钠的缓冲液。对于荧光检测（ICC），叠氮钠影响较小。

三、推荐应用与操作流程

以下稀释度范围为推荐起始条件，因不同重组蛋白的表达水平和融合标签位置（N端/C端）可能影响抗体识别效率，用户需进行滴定优化。

1. 酶联免疫吸附测定 (ELISA)

直接包被或检测：

包板浓度：1:100 – 1:500（如用于捕获抗体包被，推荐1:200稀释，约5 ?g/ml）

检测稀释度：1:1,000 – 1:30,000（作为一抗检测包被的Myc标签蛋白）

操作建议：

包被：将纯化的Myc标签蛋白或细胞裂解物（已知含Myc标签）用碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释，4°C过夜。

封闭：1% BSA或5%脱脂奶粉的PBS-T（0.05% Tween-20），室温1小时。

一抗孵育：按1:1000–1:5000稀释于封闭液中，室温1–2小时。

洗涤：PBST洗涤3次。

二抗：HRP标记的山羊抗兔IgG (H+L)，按推荐稀释度使用。

显色：TMB底物，450 nm读板。

2. 免疫细胞化学 (ICC)

稀释范围：1:100 – 1:400

样本准备：瞬时或稳定转染Myc标签融合蛋白的细胞（如HeLa、293T），接种于盖玻片或孔板。

操作流程：

1. 固定：4%多聚甲醛室温10–15分钟。

2. 透化：0.1% Triton X-100（或0.5% saponin）室温10分钟（视目标蛋白定位而定；膜蛋白检测可省略透化）。

3. 封闭：3% BSA + 5%正常山羊血清，室温30分钟。

4. 一抗孵育：按1:100–1:400稀释于封闭液中，4°C过夜。

5. 洗涤：PBS洗涤3次。

6. 荧光二抗孵育：使用Alexa Fluor标记的山羊抗兔IgG（1:500），避光室温1小时。

7. 复染：DAPI染色细胞核。

8. 封片：抗荧光淬灭封片剂，共聚焦或荧光显微镜观察。

阳性对照：表达已知Myc标签蛋白的细胞；阴性对照：未转染细胞或使用兔正常IgG替代一抗。

3. 免疫沉淀 (IP)

用量：1 – 4 ?g抗体 / mg总蛋白裂解物

推荐起始用量：对于高表达的重组蛋白（如过表达系统），使用1–2 ?g/mg；对于低表达的内源性水平（通常无内源性Myc标签，除非敲入模型），使用4 ?g/mg。

操作步骤：

1. 裂解细胞：使用非变性IP裂解缓冲液（如50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40，含蛋白酶抑制剂）。

2. 预清除：裂解液与Protein A/G磁珠（或琼脂糖珠）孵育30分钟，去除非特异性结合。

3. 抗体结合：取澄清裂解液（1 mg总蛋白），加入1–4 ?g抗体，4°C旋转孵育2–4小时或过夜。

4. 捕获：加入20–30 ?l Protein A/G磁珠，继续孵育1–2小时。

5. 洗涤：用裂解缓冲液洗涤磁珠3–5次。

6. 洗脱：加入2×SDS上样缓冲液，95°C变性5分钟，取上清进行WB分析。

注意事项：若后续WB检测使用抗兔二抗，IP洗脱样品中的抗体重链（~55 kDa）和轻链（~25 kDa）会被二抗识别，可能干扰目标蛋白（若其在55或25 kDa附近）。建议使用抗兔IgG轻链特异性HRP二抗进行WB检测，或在封闭液中加入5%正常猪血清以减少干扰。

4. 蛋白质印迹 (WB)

稀释范围：1:1,000 – 1:30,000（极宽动态范围，体现高灵敏度）

起始建议：从1:2,000开始。若信号过强（过表达系统），可稀释至1:10,000–1:30,000；若信号弱（内源性或低表达），可提高至1:1,000。

封闭液：5%脱脂奶粉的TBST（含0.1% Tween-20）。

一抗孵育：4°C过夜（推荐）或室温2小时。

膜与转膜：常规PVDF或硝酸纤维素膜，标准湿转或半干转。

二抗：山羊抗兔IgG(H+L)-HRP（货号A120-101P），稀释度1:5,000–1:20,000。

IP后WB：若一抗为IP所用的兔抗Myc，WB检测时应使用抗兔IgG轻链HRP二抗（避免重链干扰）。该二抗需在封闭缓冲液中加入5%正常猪血清（货号S100-020）以降低背景。

显色：化学发光（ECL）底物，曝光时间依信号强度调整。

预期条带：目标蛋白分子量 = 目的蛋白 + Myc标签（~1.2 kDa）。应在相应位置检测到特异条带。阴性对照（未转染裂解液）无条带。

四、注意事项与质量控制

应用验证：说明书标注“Not all listed applications have been specifically tested by our laboratory”。虽然提供了各应用的稀释范围，但用户需根据实际样本自行优化。尤其ELISA包被浓度和ICC的固定/透化条件可能需要调整。

标签位置影响：若Myc标签融合在蛋白的N端，可能被部分蛋白酶切割；C端标签更稳定但可能掩盖某些功能域。检出信号强弱与标签暴露程度相关，若WB信号弱，可尝试使用变性更强（如RIPA）的裂解液，使标签充分暴露。

阳性对照：强烈建议使用已知表达的Myc标签阳性裂解物（如商业化的Myc标签蛋白或转染Myc-空载体的细胞裂解液）作为WB阳性对照，以排除抗体失效或操作问题。

交叉反应性：该抗体针对合成肽段制备，不识别内源性人c-Myc蛋白（除非目的蛋白序列恰好包含该表位，但天然c-Myc往往被屏蔽）。因此，在未转染的哺乳动物细胞裂解物中不应出现信号。若出现非预期条带，可能是由于与其他蛋白的交叉反应（极罕见）或非特异性结合。

储存稳定性：2–8°C可稳定保存1年。切勿冷冻。长期使用建议分装（每管10–20 ?l）于微量离心管中，仍冷藏保存，避免反复开盖导致污染或效价下降。