AAT Bioquest-Cell Meter流式细胞仪钙测定试剂盒：细胞钙通量监测方案

AAT Bioquest-Cell Meter?流式细胞术钙测定试剂盒提供了基于荧光的检测方法，用于通过流式细胞仪检测细胞内钙动员。它可以用于动力学读取或终点读取。将Calbryte? 520 AM染料加载到感兴趣的细胞中，简单地洗涤细胞并添加钙通量激动剂，然后可以通过流式细胞仪使用动力学读取模式或终点读取模式读取样品。Calbryte? 520 AM可以通过扩散被动穿过细胞膜。一旦进入细胞内，Calbryte? 520 AM的亲脂性阻断基团被酯酶切割，产生一个带负电荷的荧光染料，留在细胞内。其荧光在与钙结合时大大增强。当用激动剂刺激表达感兴趣GPCR的细胞时，受体会信号释放细胞内钙，这显著增加了Calbryte? 520的荧光。Cell Meter?流式细胞术钙测定试剂盒可用于监测细胞钙通量以及细胞分选。

艾美捷AAT Bioquest-Cell Meter?流式细胞仪钙测定试剂盒：

单位大小：100次测试

目录编号：36310

激发（纳米）：493

发射（纳米）：515

量子产率：0.751

H-短语：H303, H313, H333

危害符号：XN

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

UNSPSC：12352200

激发：488纳米激光

发射：530, 30纳米滤光片

仪器规格：FITC通道

库存溶液的准备

除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在准备后分成单次使用的小份，并在-20°C下储存。避免反复冻融。

Calbryte? 520 AM库存溶液（500X）：

向Calbryte? 520 AM库存溶液（组分A）的瓶中加入100微升DMSO（未提供）并充分混合。注意：100微升Calbryte? 520 AM库存溶液足够100次测定。如果管子密封严密，未使用的Calbryte? 520 AM库存溶液可以分装并在<-20°C下储存超过一个月。避光并避免反复冻融。

样品实验协议：

去除细胞培养基并加入0.5毫升测定缓冲液。注意：对于贴壁细胞和非贴壁细胞，建议分别使用4 X10^5 – 8 X10^5和1X10^6 - 2X10^6。每个细胞系应单独评估，以确定细胞内钙动员的最佳细胞密度。

向测定缓冲液（组分B）中的0.5毫升非贴壁或贴壁细胞中加入1微升Calbryte? 520 AM库存溶液（500X）。注意：如果您的细胞（如CHO细胞）包含有机阴离子转运体，则可以在染料工作溶液中加入丙磺舒（组分C）（最终井中浓度将为0.125-1 mM）以减少脱酯化指示剂的泄漏。

在37°C下孵育细胞30分钟。

对于非贴壁细胞，离心细胞并去除染料。用0.4毫升HHBS（组分D）重悬细胞。对于贴壁细胞，使用0.5 mM EDTA轻轻将细胞从板子上脱落并离心。用0.4毫升HHBS（组分D）重悬细胞。注意：为了从板子上脱落贴壁细胞，可以考虑使用酶试剂（例如胰酶，Accutase），但需要测试以确保细胞表面的感兴趣受体不受影响。

用HHBS或您所需的缓冲液准备5倍激动剂化合物。

在流式细胞仪上使用530/30纳米滤光片（FITC通道）分析加入100微升准备好的激动剂前后的样品。注意：为了获得最佳结果，加入激动剂后1分钟内运行测定非常重要。同样重要的是确保所有样品在激动剂添加和实际读取开始之间的时间保持恒定。

图：通过Cell Meter?流式细胞仪钙测定试剂盒在CHO-K1细胞中测量ATP诱导的细胞内钙释放。在37°C下用Calbryte?520 AM染料孵育细胞30分钟，然后向细胞中加入10?M ATP。获取基线，并在添加ATP后分析其余细胞。反应是随着时间的推移而测量的。分析是在NovoCyte?3000流式细胞仪上完成的。图表上的箭头表示添加ATP和实际分析之间的时间（30秒）。

AAT Bioquest-Cell Meter流式细胞仪钙测定试剂盒文献参考：

Fluorescence absorbance inner-filter decomposition: the role of emission shape on estimates of free Ca(2+) using Rhod-2

Authors: Territo PR, Heil J, Bose S, Evans FJ, Balaban RS.

Journal: Appl Spectrosc (2007): 138

Protein kinase C and myocardial calcium handling during ischemia and reperfusion: lessons learned using Rhod-2 spectrofluorometry

Authors: Stamm C, del Nido PJ.

Journal: Thorac Cardiovasc Surg (2004): 127

Novel fluo-4 analogs for fluorescent calcium measurements

Authors: Martin VV, Beierlein M, Morgan JL, Rothe A, Gee KR.

Journal: Cell Calcium (2004): 509

Kinetic characterization of novel NR2B antagonists using fluorescence detection of calcium flux

Authors: Bednar B, Cunningham ME, Kiss L, Cheng G, McCauley JA, Liverton NJ, Koblan KS.

Journal: J Neurosci Methods (2004): 247

Cytosolic calcium in the ischemic rabbit heart: assessment by pH- and temperature-adjusted rhod-2 spectrofluorometry

Authors: Stamm C, Friehs I, Choi YH, Zurakowski D, McGowan FX, del Nido PJ.

Journal: Cardiovasc Res (2003): 695

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