BPS Bioscience 稳定荧光标记细胞系：RFP/GFP 安全港 HEK293 细胞系

RFP/GFP安全港HEK293细胞系是一种稳定的HEK293细胞系，持续表达RFP（红色荧光蛋白）和CopGFP（Pontellina plumata绿色荧光蛋白），它们已稳定整合到19号染色体上的AAVS1安全港位点。

RFP的表达由CMV启动子驱动，而CopGFP由EF1A启动子驱动。结合的DNA片段（CMV-RFP-bGH Poly A-EF1A-CopGFP-T2A-Puro-SV40 Poly A）（图1）使用CRISPR/Cas9技术整合到AAVS1安全港位点。通过限制稀释获得单克隆群体。预计这种细胞系的行为将类似于亲本HEK293细胞系。

图1：在AAVS1位点的转基因整合。

背景：

人类19号染色体上的AAVS1（也称为PPP1R12C位点）是经过充分验证的“安全港”位点，用于承载DNA转基因。AAVS1具有开放的染色质结构，并且具有转录能力。最重要的是，通过插入DNA转基因破坏AAVS1位点对细胞没有已知的不良影响。与使用其他方法（如慢病毒感染或细胞转染）获得的随机整合相比，特别针对AAVS1位点是一个主要优势，这些方法可能会引起插入性突变或破坏重要基因或细胞过程。RFP（红色荧光蛋白）是来自Dsred的红橙色衍生物，最初从Discosoma中分离出来，而GFP（绿色荧光蛋白）呈现绿色荧光，最初在Aequorea Victoria中被发现。后来发现的Pontellina plumata GFP（CopGFP）是一种超亮且成熟速率快的荧光蛋白。荧光蛋白的存在允许通过流式细胞仪或荧光显微镜进行细胞识别和定量，以及体内定位研究，提供简单的检测读数。

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应用：

- 作为基于细胞的检测中的对照。

- 用于引入进一步感兴趣的修改。

细胞培养协议：

注意：HEK293细胞源自人类材料，因此建议采取适当的安全预防措施。

细胞解冻：

1. 从液氮存储中取出一个细胞瓶。在准备好解冻之前，将其保存在干冰上。

2. 准备好解冻时，在37°C水浴中旋转冷冻细胞瓶大约60秒。一旦细胞解冻（可能比60秒稍快或稍慢），迅速将瓶中的内容转移到一个空的50毫升锥形管中。

注意：在37°C水浴中放置细胞太久会导致活性迅速丧失。

3. 使用10毫升的血清学移液管，慢慢地向含有细胞的锥形管中加入10毫升预热的解冻培养基6。解冻培养基6应该滴加，同时轻轻摇晃锥形管，以实现温和混合，避免渗透冲击。

4. 立即以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并将细胞在5毫升预热的解冻培养基6中重悬。

5. 将重悬的细胞转移到T25或T75培养瓶中，并在37°C、5% CO2培养箱中培养。

6. 培养24小时后，检查细胞附着和活力。更换为新鲜的解冻培养基6，并在37°C、5% CO2培养箱中继续培养，直到细胞准备好传代。

7. 细胞应在完全融合前传代。

细胞传代：

1. 抽吸培养基，用无Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并用0.05% Trypsin/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入解冻培养基6并转移到管中。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并将细胞在解冻培养基6中重悬。

4. 按照推荐的次培养比例1:6至1:8每周或每周两次，将细胞种植到新的培养容器中。

细胞冷冻：

1. 抽吸培养基，用无Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并用0.05% Trypsin/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入解冻培养基6并计数细胞。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并将细胞在4°C细胞冷冻培养基（BPS Bioscience #79796）中重悬，细胞浓度约为2 x 10^6细胞/ml。

4. 将1毫升的细胞悬浮液分装到每个冷冻瓶中。将瓶子放入绝缘容器中缓慢冷却，并在-80°C下过夜保存。

5. 次日将瓶子转移到液氮中进行长期存储。

注意：建议扩展细胞并在早期传代时至少冷冻10瓶细胞以备将来使用。

图2：通过PCR（聚合酶链反应）稳定整合到AAVS1安全港位点。

在整合的5'端，跨越19号染色体AAVS1位点和CMV RFP整合开始的区域通过PCR扩增，预计大小为1.1 kb。在整合的3'端，跨越EF1α GFP-Puro整合和19号染色体AAVS1位点的区域通过PCR扩增，预计大小为1.2 kb。使用亲本HEK293细胞作为对照。

BPS Bioscience是一家通过ISO 9001:2015认证的生命科学领域的供应商，公司一直致力于开发药物研发领域的重组蛋白酶、蛋白酶活性/抑制剂筛选试剂盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年创立，从创立至今一直致力于提供药物研发领域的创新解决方案，以推动新的药物发现。公司主要关注的领域包括免疫疗法、表观遗传学、新型冠状病毒、CRISPR、细胞信号转导等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白甲基化转移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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