RhoA G-LISA活化检测试剂盒，从裂解液到比色读数的一站式平台

一、产品概述与核心应用场景

由艾美捷代理Cytoskeleton推出的RhoA G-LISA 活化检测试剂盒（比色法）（货号：BK124）是一款基于亲和结合原理的定量检测系统，专为细胞与组织裂解液中活化态（GTP结合态）RhoA蛋白的分析而设计。该试剂盒采用96孔板形式，适用于24至96次反应，其条带式孔板设计支持单次或多次实验的灵活安排。

本试剂盒主要应用于以下研究场景：RhoA信号通路调控机制解析、活化抑制剂的筛选评估，以及裂解液样本量受限情况下的检测需求（如原代细胞培养物）。其核心优势在于检测灵敏度高、操作流程标准化，可在约3小时内完成从样本上样到结果读取的全流程。

二、试剂盒组分与材料清单

提供的试剂与耗材：

96孔RhoA-GTP结合板

抗RhoA一抗

HRP标记二抗

组成型活性RhoA对照蛋白

细胞裂解液（针对GTP酶GTP结合状态维持优化）

结合缓冲液、洗涤缓冲液、抗原呈递缓冲液、抗体稀释缓冲液

HRP比色检测试剂A液与B液、HRP终止液

Precision Red总蛋白定量试剂、蛋白酶抑制剂混合物、板架

需自备的设备与材料：

4°C预冷PBS缓冲液（pH 7.2，组成为10 mM磷酸盐、140 mM NaCl、3 mM KCl）

细胞刮刀、液氮（用于裂解液速冻）、浓硫酸（1 ml，用于终止液配制）

多通道移液器（25–200 ul量程）及配套加样槽

涡旋混合器、两台轨道微孔板摇床（一台4°C、一台室温，转速不低于200 rpm，推荐400 rpm）

酶标仪（检测波长490 nm）

三、检测原理与操作流程

本试剂盒采用G-LISA?（GTPase-Linked Immunosorbent Assay）技术平台。其核心原理如下：将效应蛋白的Rho结合结构域（RBD）预先包被于96孔板孔内。当加入细胞或组织裂解液后，活化态（GTP结合）的RhoA蛋白被特异性捕获固定于孔板表面，而失活态（GDP结合）的RhoA则于后续洗涤步骤中被清除。随后，依次加入RhoA特异性抗体和HRP标记二抗，通过比色法对捕获的活化RhoA进行定量检测。

关键操作步骤：

1. 细胞裂解液制备（建议蛋白上样量10–50 ug/孔）

2. 裂解液上样与结合孵育（4°C摇床）

3. 洗涤去除未结合成分

4. 抗原呈递处理

5. 一抗孵育、洗涤、二抗孵育、洗涤

6. HRP底物显色与终止

7. 490 nm波长读取吸光度

四、关键性能参数与技术要点

参数 | 指标

检测类型 | 定量比色法 |

检测特异性 | RhoA（不与RhoB/C发生交叉反应）

检测灵敏度 | 活化RhoA线性范围10 pg – 1 ng

样本需求量 | 每孔10–50 ug裂解液总蛋白

总耗时 | 约3小时

技术注意事项：

活化水平参照的建立：建议设置非活化对照（通常通过血清饥饿处理细胞），通过比较活化组与对照组的吸光度值计算RhoA活化倍数。具体操作指南可参见Cytoskeleton公司官网技术文档。

样本制备关键点：裂解后建议使用液氮速冻并于–80°C保存，避免反复冻融导致GTP水解。

总蛋白定量：本试剂盒配套Precision Red试剂可用于裂解液总蛋白测定，便于统一上样量。

摇床温度与转速需严格控制，低温孵育步骤（结合步骤）应在4°C条件下进行以保证GTP结合状态的稳定。

本试剂盒适用于基础信号转导研究、药物筛选及疾病模型中RhoA活化状态的系统评估，为其可靠的定量分析提供了标准化的技术解决方案。

文献参考

1. Schoenwaelder S.M. et al. 2000. The protein tyrosine phosphatase Shp-2 regulates RhoA activity.Current Biol. 10, 1523-1526.