Immusmol超越TH成像：在帕金森病模型中检测中脑类器官的多巴胺含量

自 2016 - 2017 年有关利用干细胞培养出中脑类器官的早期研究论文发表以来，研究团队一直致力于证明这些三维微组织中存在具有功能性的多巴胺能神经元。多巴胺能功能的一个广受认可且被普遍接受的标志物是酪氨酸羟化酶（TH）——这种酶能将 L-酪氨酸转化为 L-多巴，而后者是多巴胺的前体物质。

然而，TH 的表达并不一定意味着神经元处于活跃代谢状态并产生多巴胺。因此，一些对基于器官体模型研究帕金森病感兴趣的团队将多巴胺能神经元的标准标志物（如 TH 和 GIRK2）与使用抗半抗原抗体Dopamine Antibody – Rabbit Polyclonal（货号：IS1005）直接对多巴胺进行染色，以及用于定量分析上清液中多巴胺释放的 ELISA 试剂盒Dopamine ELISA kit – Any sample（货号：BA-E-5300R）相结合。

五篇展示人类中脑组织培养物中多巴胺合成过程的精选文章

1.这篇具有重要开创意义的论文（引用次数超过 350 次）描述了人类神经上皮干细胞在第 50 天后向中脑特异性组织体的三维分化过程，其中包含能产生多巴胺的神经元。

2017 年，来自卢森堡系统生物医学中心（LCSB）的詹斯·施瓦姆邦恩团队发布了首个生成干细胞衍生中脑组织体的方案。该团队在分化后第 50 天证明了存在中脑特异性的多巴胺能神经元，使用了诸如 TH、TUJ1、GIRK2、CALBINDIN、多巴胺转运体以及多巴胺本身等标志物，并使用 IS1005 抗体进行检测。

[1] Monzel et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 2017 May 9;8(5):1144-1154. doi: 10.1016/j.stemcr.2017.03.010. Epub 2017 Apr 13.

2.在第 70 天后对中脑组织胚体进行 TH 和多巴胺的全组织染色，并对多巴胺释放量进行定量分析

2019 年，施瓦姆伯恩小组与来自马克斯·普朗克研究所和汉诺威医学院的同事合作，发表了一种用于生成中脑组织胚体的替代方案（引用次数超过 200 次），该方案始于从诱导多能干细胞（hiPSC）中分离出的中脑底板神经祖细胞（mfNPCs）。他们通过 TH 和多巴胺的共染色证明了 70 天后存在产生多巴胺的神经元，并且通过酶联免疫吸附测定ELISA（货号：BA-E-5300R）测量到多巴胺释放量在分化过程中的显著增加（第 35 天、第 70 天）。他们还验证了该方案可用于使用帕金森病患者的诱导多能干细胞进行体外帕金森病模型的构建。

[2] Smits et al. Modeling Parkinson’s disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 2019 Apr 5;5:5. doi: 10.1038/s41531-019-0078-4.

3.经过 30 天培养后（整体染色），优化后的中脑类器官中已存在具有功能的多巴胺能神经元，并且暴露于 6-羟基多巴胺以模拟帕金森病。

2020 年，施瓦姆邦小组优化了他们 2019 年的方案，以减少批次间的差异并避免形成坏死核心。他们通过 TH、GIRK2、多巴胺转运体和多巴胺含量的共染色，证明了所得 3D 微组织中的多巴胺能功能。

[3] Nickels et al. Reproducible generation of human midbrain organoids for in vitro modeling of Parkinson’s disease. Stem Cell Res. 2020 Jul;46:101870. doi: 10.1016/j.scr.2020.101870. Epub 2020 Jun 6.

4.在分化后第 30 天（即在 6-羟基多巴胺损伤发生及使用间充质干细胞分泌物治疗之前）的中脑组织球体的全切片染色中，TH、GIRK2 和多巴胺的表达情况如下：

2023 年，为了评估间充质干细胞分泌物的治疗潜力，来自葡萄牙米尼奥大学的一个研究团队采用了斯米茨等人[2]所描述的方案，生成了重现帕金森病样多巴胺能退化的中脑组织球体。为了在 6-羟基多巴胺暴露之前证明多巴胺能功能，他们对组织球体切片进行了 TH、GIRK2 和多巴胺（IS1005 抗体）的染色。

[4] Mendes-Pinheiro et al. Treating Parkinson’s Disease with Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Secretome: A Translational Investigation Using Human Brain Organoids and Different Routes of In Vivo Administration. Cells. 2023 Nov 2;12(21):2565. doi: 10.3390/cells12212565.

5.一种用于药物研发和毒性研究的高通量器官组织平台：展示成熟多巴胺能神经元（TH、GIRK2）的存在以及微中脑器官组织中多巴胺及神经黑素样颗粒的生成（分化后第 30 天）

2023 年，来自韩国的一个公私合作组织公布了一个用于生成功能性微中脑器官组织的高通量平台。该平台旨在进行大规模的药物研发和毒性研究，其基于 96 孔和 384 孔板中的单步过程，在 4 周内生成具有最小变异性的成熟大脑器官组织。这些结果器官组织表现出细胞多样性，并通过使用 TH 和 GIRK2 以及多巴胺和神经黑素样颗粒的生成来分析其多巴胺能成分。

[5] Yao et al. Production of Highly Uniform Midbrain Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Int. 2023 Sep 29;2023:3320211. doi: 10.1155/2023/3320211.

如何对中脑组织球进行多巴胺染色？一份实用指南：

施瓦姆伯恩小组在其第一篇论文中介绍了制备中脑组织球切片的方案，使用了多聚甲醛固定法和低熔点琼脂糖。与 PFA 固定的组织相兼容的原代多巴胺抗体Primary dopamine antibody  （货号：IS1005），按照标准流程成功使用了。

然而，为了减少组织切片中的背景噪音并标记完整的标本中的多巴胺，我们建议使用 STAINperfect 染色试剂盒（货号：SP-A-1000）。该试剂盒与 10 种关键神经递质的抗体兼容，并设计用于多重成像，2020 年，由来自 RIKEN 和加州大学的 Jens Schwamborn 等人的团队使用该免疫染色试剂盒，以证明人类中脑组织培养物中存在产生多巴胺、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和血清素的神经元。