iFluor 647琥珀酰亚胺酯物：生物分子荧光标记专家

AAT Bioquest的iFluor 染料经过优化，可用于标记蛋白质，特别是抗体。这些染料明亮、耐光，对蛋白质的淬灭作用最小。它们可以被荧光仪器的主要激光线（例如350、405、488、555和633nm）很好地激发。iFluor?647系列的光谱特性与Cy5 基本相同。与Cy5?探针相比，iFluor 647试剂具有更强的荧光和更高的光稳定性。它们的荧光在pH 3至11范围内与pH无关。这些光谱特性使这种新的染料家族成为Cy5和Alexa Fluor 647的绝佳替代品（Cy5与Alexa Fluor是GE Health Care和Invitrogen的商标）。iFluor?647 SE相当稳定，与蛋白质氨基具有良好的反应性和选择性。

艾美捷iFluor 647琥珀酰亚胺酯：

货号：AAT-71560

单位大小：1 毫克

分子量：1274.66

溶剂：DMSO（二甲基亚砜）

校正因子（260 纳米）：0.03

校正因子（280 纳米）：0.03

校正因子（656 纳米）：0.0793

消光系数（cm -1 M -1）：250000

激发（纳米）：656

发射（纳米）：670

量子产率：0.25

H-短语：H303, H313, H333

危险符号：XN

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存：冷冻（< -15 °C）；尽量减少光照暴露

库存溶液的准备：除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在制备后分成单次使用的小份，并储存在 -20 °C。避免反复冻融循环。

蛋白质库存溶液（溶液 A）：

将 100 微升的反应缓冲液（例如，1 M 碳酸钠溶液或 pH 约 9.0 的 1 M 磷酸缓冲液）与 900 微升的目标蛋白质溶液（例如，抗体，蛋白质浓度尽可能大于 2 mg/mL）混合，得到 1 毫升蛋白质标记库存溶液。

注意：蛋白质溶液（溶液 A）的 pH 值应为 8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的 pH 值低于 8.0，请使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸缓冲液调整 pH 值至 8.0-9.0 范围内。

注意：蛋白质应溶解在 1X 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果蛋白质溶解在 Tris 或甘氨酸缓冲液中，必须对其进行透析，以对抗 1X PBS，pH 7.2-7.4，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。

注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体将不会被很好地标记。亚硝酸钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。亚硝酸钠或硫柳汞可以通过透析或旋转柱来去除，以获得最佳的标记结果。

注意：如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，偶联效率将显著降低。为了获得最佳的标记效率，建议最终蛋白质浓度范围在 2-10 mg/mL 之间。

iFluor? 647 SE 库存溶液（溶液 B）：

向 iFluor? 647 SE 的瓶中加入无水 DMSO，制成 10 mM 库存溶液。通过移液或涡旋混合均匀。

注意：在开始偶联之前准备染料库存溶液（溶液 B）。请立即使用。染料库存溶液的长期储存可能会降低染料活性。溶液 B 可以在避光和防潮的情况下在冷冻库中储存两周。避免冻融循环。

样品实验协议：

这个标记协议是为山羊抗小鼠 IgG 与 iFluor? 647 SE 的偶联而开发的。您可能需要根据您的特定蛋白质进行进一步优化。

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。过度标记蛋白质可能会对其结合亲和力产生不利影响，而染料/蛋白质比例过低的蛋白质偶联物则灵敏度降低。

进行偶联反应：

使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比例作为起点：将 5 微升的染料库存溶液（溶液 B，假设染料库存溶液为 10 mM）加入蛋白质溶液（95 微升的溶液 A）的瓶中，并有效摇动。假设蛋白质浓度为 10 mg/mL，蛋白质分子量约为 200KD，蛋白质的浓度约为 0.05 mM。

注意：我们建议使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）的摩尔比例。如果太低或太高，请分别确定 5:1、15:1 和 20:1 的最佳染料/蛋白质比例。

继续在室温下旋转或摇动反应混合物 30-60 分钟。

纯化偶联物：

以下是一个使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例协议。

根据制造商的说明准备 Sephadex G-25 柱。

将反应混合物（来自“运行偶联反应”）加载到 Sephadex G-25 柱的顶部。

当样品刚刚低于顶部树脂表面时，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

添加更多的 PBS（pH 7.2-7.4）以完成所需的样品柱纯化。合并包含所需染料-蛋白质偶联物的分数。

注意：如果立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。

注意：对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

表征所需的染料-蛋白质偶联物

取代度（DOS）是表征染料标记蛋白质的最重要因素。较低 DOS 的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高 DOS 的蛋白质也倾向于降低荧光。对于大多数抗体，推荐的最优 DOS 在 2 到 10 之间，具体取决于染料和蛋白质的性质。为了有效标记，应控制取代度，使每摩尔抗体有 4-6 摩尔的 iFluor? 647 SE。以下步骤用于确定 iFluor? 647 SE 标记蛋白质的 DOS。

测量吸收：

为了测量染料-蛋白质偶联物的吸收光谱，建议保持样品浓度在 1-10 ?M 范围内，具体取决于染料的消光系数。

读取 OD（吸光度）在 280 纳米和染料最大吸收（λmax = 656 纳米，对于 iFluor? 647 染料）

对于大多数分光光度计，需要将样品（来自柱分数）用去离子水稀释，以便 OD 值在 0.1 到 0.9 的范围内。280 纳米的 O.D.（吸光度）是蛋白质的最大吸收，而 656 纳米是 iFluor? 647 SE 的最大吸收。为了获得准确的 DOS，请确保偶联物中不含未偶联的染料。

图：HeLa细胞用小鼠抗微管蛋白染色，然后用iFluorTM 647山羊抗小鼠IgG（H+L）（红色）染色；细胞核用DAPI（蓝色）染色。