iFluor 350马来酰亚胺：蛋白质和抗体标记的光稳定性荧光染料

AAT Bioquest的iFluor?染料经过优化，特别适合标记蛋白质，尤其是抗体。这些染料亮度高、光稳定性好，并且在蛋白质上几乎不发生猝灭。它们可以被荧光仪器的主要激光线很好地激发（例如，350、405、488、555和633纳米）。iFluor? 350染料的荧光激发和发射最大值分别约为345纳米和450纳米。这些光谱特性使它们成为AMCA和Alexa Fluor? 350标记染料（Alexa Fluor?是Invitrogen的商标）的极佳替代品。iFluor? 350马来酰亚胺的稳定性合理，并且对巯基具有良好的反应性和选择性。

艾美捷iFluor 350马来酰亚胺：

货号：AAT-1060

单位大小：1 毫克

分子量：355.34

溶剂：DMSO

校正因子（260 纳米）：0.83

校正因子（280 纳米）：0.23

消光系数（cm -1 M -1）：200001

激发（纳米）：345

发射（纳米）：450

量子产率：0.951

H-短语：H303, H313, H333

危险符号：XN

预期用途：仅限研究使用（RUO）

R-短语：R20, R21, R22

储存：冷冻（< -15 °C）；尽量减少光照暴露

库存溶液的准备：

除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在制备后分成单次使用的小份，并储存在 -20 °C。避免反复冻融循环。

iFluor? 350 马来酰亚胺库存溶液（溶液 B）：

向iFluor? 350 马来酰亚胺的瓶中加入无水DMSO，制成10 mM的库存溶液。通过移液或涡旋混合均匀。

注意：在开始偶联之前准备染料库存溶液（溶液 B）。请立即使用。延长染料库存溶液的储存可能会降低染料活性。溶液 B 可以在避光和防潮的情况下在冷冻库中储存长达4周。避免冻融循环。

蛋白质库存溶液（溶液 A）：

将100 ?L的反应缓冲液（例如，pH约6.0的100 mM MES缓冲液）与900 ?L的目标蛋白质溶液（例如，抗体，蛋白质浓度尽可能大于2 mg/mL）混合，得到1 mL的蛋白质标记库存溶液。

注意：蛋白质溶液（溶液 A）的pH值应为6.5 ± 0.5。

注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白质稳定的抗体不会被很好地标记。

注意：如果蛋白质浓度低于2 mg/mL，偶联效率将显著降低。为了获得最佳的标记效率，建议最终蛋白质浓度范围在2-10 mg/mL之间。

可选：如果您的蛋白质不含有游离的半胱氨酸，您必须用DTT或TCEP处理您的蛋白质以生成巯基。DTT或TCEP用于将二硫键转换为两个游离的巯基。如果使用DTT，您必须在将染料马来酰亚胺偶联到您的蛋白质之前，通过透析或凝胶过滤去除游离的DTT。以下是生成游离巯基的示例协议：

用蒸馏水准备新鲜的1 M DTT溶液（15.4 mg/100 ?L）。

在20 mM DTT中制备IgG溶液：每毫升IgG溶液中加入20 ?L的DTT库存，同时混合。在室温下静置30分钟，无需额外混合（以最小化半胱氨酸重新氧化为胱氨酸）。

将还原的IgG通过预平衡的“交换缓冲液”的过滤柱。收集柱上的0.25 mL分数。

测定蛋白质浓度，并汇集含有大部分IgG的分数。这可以通过分光光度法或比色法完成。

在此步骤后尽快进行偶联（见样品实验协议）。

注意：IgG溶液应大于4 mg/mL以获得最佳结果。如果抗体浓度低于2 mg/mL，则应浓缩抗体。在缓冲液交换柱上损失额外的10%。

注意：还原可以在几乎任何pH 7-7.5的缓冲液中进行，例如MES、磷酸盐或TRIS缓冲液。

注意：步骤3和4可以被透析替代。

样品实验协议：

这个标记协议是为山羊抗小鼠IgG与iFluor? 350 马来酰亚胺的偶联而开发的。您可能需要针对您的特定蛋白质进行进一步优化。

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。过度标记蛋白质可能会对其结合亲和力产生不利影响，而染料/蛋白质比例过低的蛋白质偶联物则灵敏度降低。

运行偶联反应：

使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比例作为起点：将5 ?L的染料库存溶液（溶液B，假设染料库存溶液为10 mM）加入到蛋白质溶液（95 ?L的溶液A）的瓶中，并有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg/mL，蛋白质分子量约为200KD，蛋白质的浓度约为0.05 mM。

注意：我们建议使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比例。如果太低或太高，请分别确定5:1、15:1和20:1的最佳染料/蛋白质比例。

继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

纯化偶联物：

以下是一个使用Sephadex G-25柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例协议。

根据制造商的说明准备Sephadex G-25柱。

将反应混合物（来自“运行偶联反应”）加载到Sephadex G-25柱的顶部。

当样品刚刚低于顶部树脂表面时，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。

添加更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成所需的样品柱纯化。合并包含所需染料-蛋白质偶联物的分数。

注意：如果立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。

注意：对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

表征所需的染料-蛋白质偶联物：

取代度（DOS）是表征染料标记蛋白质的最重要因素。较低DOS的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高DOS的蛋白质也倾向于降低荧光。对于大多数抗体，推荐的最优DOS在2到10之间，具体取决于染料和蛋白质的性质。为了有效标记，应控制取代度，使每摩尔抗体有5-8摩尔的iFluor? 350 马来酰亚胺。以下步骤用于确定iFluor? 350 马来酰亚胺标记蛋白质的DOS。

测量吸收：

为了测量染料-蛋白质偶联物的吸收光谱，建议保持样品浓度在1-10 ?M范围内，具体取决于染料的消光系数。

读取OD（吸光度）在280纳米和染料最大吸收（λmax = 345纳米，对于iFluor? 350染料）

对于大多数分光光度计，需要将样品（来自柱分数）用去离子水稀释，以便OD值在0.1到0.9的范围内。280纳米的O.D.（吸光度）是蛋白质的最大吸收，而345纳米是iFluor? 350 马来酰亚胺的最大吸收。为了获得准确的DOS，请确保偶联物中不含未偶联的染料。

图：HeLa细胞用小鼠抗微管蛋白染色，然后用iFluor 350山羊抗小鼠IgG（H+L）染色。