高亲和力兔抗HIF2-α重组单克隆抗体，高原缺氧与肿瘤研究核心工具

产品核心特性

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的抗HIF2?α抗体（货号A700-003，克隆号BL-95-1A2）是一款重组兔单克隆抗体，经细胞培养上清纯化，以Whole IgG形式提供。该抗体针对人源缺氧诱导因子2α（HIF2?α，又称EPAS1）设计，在多种应用中表现优异，包括染色质免疫沉淀（ChIP）、免疫细胞化学（ICC）、免疫荧光（ICC-IF）、免疫组化（IHC）、免疫沉淀（IP）及免疫印迹（WB）。关键参数如下：

参数 详细信息

靶点 HIF2?α / EPAS1

反应性 人

宿主 兔

克隆性 重组单克隆（克隆号 BL-95-1A2）

格式 Whole IgG

浓度 400 ?g/ml

纯化方式 从细胞培养上清纯化

同种型 IgG

偶联物 未偶联

储存 2 - 8°C

有效期 1年

缓冲液 PBS，含0.1% BSA及0.09%叠氮化钠

免疫原与表位特异性

该抗体识别表位位于人HIF2?α蛋白第400至450位残基之间（参考序列NP_001421.2，GeneID 2034）。这一区域位于HIF2?α的C端转录激活域（TAD）与ODD域（氧依赖降解域）之间，具有较高的抗原性且与其他bHLH-PAS家族成员（如HIF1?α）的序列差异明显，因此可实现特异性识别。

生产优势：作为重组单克隆抗体，A700-003由稳定细胞系表达，避免了传统多克隆抗体的批次间差异，确保长期供应的一致性和可重复性。抗体经亲和纯化后浓度高达400 ?g/ml，为下游多种高灵敏度应用提供了充足保障。

储存与稳定性

储存条件：2 - 8°C，禁止冷冻。

有效期：自收货之日起1年。

缓冲液组成：磷酸盐缓冲盐水（PBS），含0.1% BSA及0.09%叠氮化钠（防腐剂）。

应用方法与推荐参数

以下应用均经过验证，用户可依据推荐条件直接使用或进行微调。

通用实验条件

所有Western Blot实验均采用5% Milk-TBST作为封闭液和抗体稀释液，一抗孵育过夜（4°C摇动）。

检测二抗：

细胞裂解液WB：羊抗兔IgG重链+轻链抗体（A120-101P）

IP洗脱液WB：抗兔IgG轻链HRP偶联抗体 + 5%正常猪血清（S100-020）封闭

各应用推荐参数

应用 推荐稀释度/用量 关键条件提示

ChIP-Seq 10 - 40 ?l / 30 ?g 染色质 过往批次已验证适用于ChIP-Seq

免疫细胞化学（ICC） 1:200 - 1:1000 甲醛固定，Triton X-100通透

免疫荧光（ICC-IF） 1:100 - 1:500 同上

免疫组化（IHC） 1:200 - 1:1000 FFPE切片需用枸橼酸盐缓冲液pH 6.0高压修复20分钟，建议一抗过夜孵育

免疫沉淀（IP） 20 ?l / mg 裂解物 本品为高浓度抗体，按体积而非质量添加

免疫印迹（WB） 1:1000 过夜孵育，建议使用同步化细胞或缺氧处理的阳性对照

详细操作要点

ChIP-Seq：该抗体过往批次已成功用于ChIP-Seq实验。推荐投入10-40 ?l抗体与30 ?g染色质共孵育。用户在使用新批次时应进行qPCR预验证（如检测HIF2?α靶基因VEGF、EPO的启动子富集）。抗体浓度较高（400 ?g/ml），建议进行小规模预实验确定最佳用量。

ICC / ICC-IF：采用4%甲醛室温固定细胞10-15分钟，PBS洗涤后使用0.1-0.5% Triton X-100通透5-10分钟。一抗稀释于含1% BSA的PBS中，4°C孵育过夜。推荐使用Alexa Fluor偶联的羊抗兔二抗进行荧光检测。阳性对照可使用低氧（1% O?）处理24小时的HeLa或786-O细胞（后者因VHL缺失而组成型表达HIF2?α）。

IHC（石蜡切片）：必须进行热诱导抗原修复。推荐使用压力锅或微波炉加热枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）至沸腾后维持20分钟。自然冷却至室温后，进行封闭和一抗孵育（4°C过夜）。使用HRP标记的二抗和DAB显色。阳性组织推荐人肾透明细胞癌或肝细胞癌切片。

IP：按20 ?l抗体/mg总蛋白裂解物的比例加入。由于该抗体浓度高（400 ?g/ml），20 ?l对应8 ?g抗体，与常规IP用量相当。推荐使用非变性裂解液（如1% NP-40，150 mM NaCl，50 mM Tris pH 7.4，蛋白酶抑制剂）。4°C旋转孵育2-4小时，加入Protein A磁珠继续孵育1-2小时。洗涤后，用SDS上样缓冲液洗脱。

WB：推荐起始稀释比为1:1000。HIF2?α分子量约为100-120 kDa（依赖于磷酸化和氧浓度）。注意：在常氧条件下，HIF2?α被VHL/E3泛素连接酶识别并迅速降解，因此WB检测需使用低氧处理或脯氨酰羟化酶抑制剂（如DMOG、CoCl?）处理的细胞裂解液。阳性对照：CoCl?（100-200 ?M，4-6小时）处理的HeLa细胞，或组成型表达HIF2?α的786-O细胞。

别名

basic-helix-loop-helix-PAS protein MOP2、bHLHe73、class E basic helix-loop-helix protein 73、ECYT4、EPAS-1、HIF-1-alpha-like factor、HIF-1α-like factor、HIF2A、HIF-2-alpha、HIF2-alpha、HLF、hypoxia-inducible factor 2 alpha、Hypoxia-inducible factor 2-alpha、member of PAS protein 2、MOP2、PAS domain-containing protein 2、PASD2

使用注意事项

1.防腐剂：缓冲液含0.09%叠氮化钠，有毒性，操作时需佩戴防护用具。叠氮化钠会抑制HRP活性，若用于HRP检测体系，需确保在封闭和洗涤步骤中充分去除（增加洗涤次数或使用不含叠氮化钠的缓冲液稀释抗体）。

2.氧浓度控制：HIF2?α在常氧下极不稳定，处理细胞样品时需严格把控氧浓度。建议在缺氧工作站（1% O?）或使用化学稳定剂（如CoCl?，100 ?M处理4-6小时；或DMOG，1 mM处理4小时）收集裂解物。裂解缓冲液中应添加蛋白酶抑制剂和去泛素化酶抑制剂（如N-乙基马来酰亚胺）。

3.阳性对照推荐：

WB：CoCl?处理的HeLa裂解物，或786-O细胞裂解物（组成型表达）。

IHC：人肾透明细胞癌组织（VHL突变，HIF2?α核阳性）。

ICC-IF：低氧处理的786-O或Hep3B细胞。

4.分子量确认：HIF2?α在SDS-PAGE中迁移位置约为100-120 kDa。由于磷酸化修饰，可能出现双条带或弥散。使用未处理与磷酸酶处理样本对比可辅助条带鉴定。

5.ChIP实验优化：初次使用建议设置10 ?l、20 ?l、40 ?l三个抗体用量梯度。同时使用阴性对照（兔IgG）和阳性对照抗体（如抗H3K4me3）。固定时间（甲醛1%室温10分钟）和染色质剪切长度（200-700 bp）需预先优化。

6.交叉反应性：已验证人反应性。经序列比对，小鼠Hif2α（NP_034269.2）在400-450区域同源性约85%，该抗体对小鼠样本的交叉反应性未经验证。如需检测小鼠，建议预先通过WB验证。