兔抗BRCA2抗体亲和纯化，特异性区分BRCA2与BRCA1及其它同源修复蛋白

本文针对艾美捷Bethyl Laboratories推出的靶向人BRCA2蛋白的兔源多克隆抗体（货号A303-434A）提供完整的技术参数解析及标准化实验方案，重点关注其在免疫沉淀和蛋白质印迹中的优化条件，适用于DNA损伤修复、肿瘤发生机制及同源重组功能研究。

一、产品基本特性

该抗体为兔多克隆抗体，以全IgG形式提供，未经任何标记。其特异性靶点为BRCA2（乳腺癌易感基因2，又称FANCD1、BRCC2），仅识别人源样本，适用于人类细胞系或组织裂解物的检测。

抗体经抗原亲和纯化处理——采用固相载体上固定的BRCA2特异性表位进行吸附洗脱，确保去除非特异性IgG，纯度满足高灵敏度检测需求。免疫原对应人BRCA2蛋白第450至500位氨基酸区域（参考序列NP_000050.1，基因ID 675）。该表位位于蛋白N端附近，避免了与BRCA1及其他DNA修复蛋白的交叉反应。

抗体浓度标定为1000 ?g/ml（通过A280测定，基于1 mg/ml IgG吸光值1.4计算），总量未标注，但可按需取用。

二、储存与缓冲体系

储存条件：2 – 8°C冷藏，严禁冷冻。反复冻融会导致抗体变性聚合，降低效价。

有效期：收货之日起1年。未开封状态下严格遵守储存条件可维持完整活性。

缓冲液组成：Tris-枸橼酸/磷酸缓冲液，pH 7–8，含0.09%叠氮钠作为防腐抑菌剂。

注意事项：叠氮钠会抑制HRP活性，若后续使用HRP标记二抗进行化学发光检测，建议在洗涤步骤中充分去除；或选用无叠氮钠的替代缓冲液（如含0.02%硫柳汞的PBS）。

三、推荐应用流程

1. 免疫沉淀 (IP)

用量：6 ?g抗体 / mg总蛋白裂解物。对于一般10 cm培养皿的细胞（约1–2 mg总蛋白），需添加12 ?g抗体。

操作建议：裂解液建议使用非变性IP裂解缓冲液（如20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40），并新鲜加入蛋白酶抑制剂（PMSF、cocktail）。抗体与裂解液共孵育2小时至过夜（4°C旋转混匀），随后采用Protein A/G磁珠或琼脂糖珠捕获免疫复合物。磁珠需预先用裂解液平衡。

2. 蛋白质印迹 (WB)

工作稀释度：1:10,000 – 1:25,000。该范围较宽，建议初次实验从1:10,000开始，若信号过强或背景偏高可逐步稀释至1:25,000。

凝胶推荐：3–8% Tris-醋酸凝胶。BRCA2分子量极大（理论约384 kDa），常规Tris-甘氨酸凝胶分离效率差；Tris-醋酸体系配合低浓度丙烯酰胺可有效分离高分子量蛋白。

封闭与稀释液：含5%脱脂奶粉的TBST（Tris-缓冲盐+0.1% Tween-20）。

一抗孵育：4°C过夜（12–16小时），这是检测高分子量、低丰度蛋白的必要条件。

检测体系差异化：

直接检测细胞裂解物中的BRCA2：推荐使用山羊抗兔IgG（H+L）HRP二抗（如A120-101P），稀释度按二抗说明书推荐。

IP后WB检测：免疫沉淀样品中洗脱的抗体包含兔IgG重链（约55 kDa）和轻链（约25 kDa）。常规抗兔HRP二抗会识别重链，产生约55 kDa条带，可能干扰目标蛋白（BRCA2为384 kDa，无干扰）？但轻链仍可能出现在25 kDa，通常不影响384 kDa检测。然而，若目标蛋白在50 kDa附近或做磷酸化检测，则必须使用抗兔IgG轻链特异性HRP二抗，同时封闭液中加入5%正常猪血清（货号S100-020）以降低非特异性吸附。对于BRCA2，因其分子量极大，重链干扰不显著，但轻链二抗能获得更干净的背景。

四、靶点生物学背景

BRCA2是最早发现的乳腺癌易感基因之一，其胚系突变显著增加女性乳腺癌和卵巢癌风险。该基因编码的蛋白质在DNA双链断裂的同源重组修复中发挥核心作用。BRCA2通过直接结合RAD51，调控RAD51在DNA损伤位点的核丝组装，促进同源重组修复。

虽然BRCA1与BRCA2在表达模式和亚细胞定位上相似，且二者表型有重叠，但它们的蛋白序列完全不同，功能上并不冗余：BRCA2更专一地在RAD51介导的修复中起作用，而BRCA1参与更广泛的DNA损伤信号网络。

BRCA2缺陷细胞对PARP抑制剂、铂类药物及交联剂高度敏感，该特性已被用于靶向治疗。此外，BRCA2的突变也导致范可尼贫血亚型D1（FANCD1），表现为骨髓衰竭和癌症易感性。

五、别名与同源性

该抗体识别的表位位于人BRCA2的第450–500残基，该区域在物种间保守性中等，因此反应性仅验证为人，不推荐用于小鼠、大鼠样本，除非通过序列比对确认100%一致性。

常见别称包括：

BRCA1/BRCA2复合物亚基2 (BRCC2)

乳腺和卵巢癌易感蛋白2

范可尼贫血D1蛋白 (FANCD1)

XRCC11

PNCA2, GLM3, FACD, FAD1等

六、注意事项与质控参数

纯化工艺：表位特异性亲和纯化，使用固定化的BRCA2 450–500肽段。  

质控建议：每次实验设置阳性对照（如HeLa、MCF7或293T细胞裂解液，BRCA2表达水平中等偏高）和阴性对照（兔免疫前IgG或仅二抗）。  

转膜条件：由于BRCA2分子量大（>350 kDa），推荐使用0.45 ?m PVDF膜，湿转法（100 V，2–3小时或30 V，4°C过夜）。甲醇浓度不宜超过10%，以免大分子沉淀。  

分子量预期：全长BRCA2约384 kDa，可能出现降解条带（~250 kDa、200 kDa）属正常现象，尤其在蛋白酶抑制不足时。