兔抗PolH抗体亲和纯化，专为DNA跨损伤合成、体细胞超突变及色素性干皮病变异型研究设计

本抗体为艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源多克隆抗体（货号：A301-231A），特异性识别DNA聚合酶η（PolH）蛋白的C末端区域（第663位至C末端，精细表位位于690–713位）。经抗原亲和纯化，提供完整IgG分子形式，未偶联任何标记物（Unconjugated），浓度为200 ?g/mL。适用于免疫沉淀（IP）和蛋白质印迹（WB），反应种属为人。

理化参数

参数项目 详细规格

目标抗原 PolH（DNA聚合酶η）

反应种属 人

宿主来源 兔

克隆类型 多克隆

抗体形式 完整IgG

免疫原 第663位至C末端之间的区域

精细表位 第690–713位氨基酸

亚型 IgG

偶联物 无

纯度 抗原亲和纯化

抗原物种 人

浓度 200 ?g/mL

保存条件 2–8 °C

有效期限 自收货起1年

缓冲体系 Tris缓冲盐水，含0.1% BSA和0.09%叠氮化钠

浓度测定依据：采用比尔定律（Beer’s Law），标准为1 mg/mL IgG在280 nm波长处的吸光值（A280）为1.4。

别名：RAD30、RAD30A、XPV、XP-V、色素性干皮病变异型蛋白。

生产与纯化流程

1. 免疫原设计：选择人PolH蛋白C末端第663位至C末端（含690–713位精细表位）的合成肽段

2. 免疫方案：免疫兔，诱导产生多克隆抗血清

3. 亲和纯化：将表位特异性肽段固定在固相支持物上，从抗血清中亲和捕获特异性抗体，去除与其他DNA聚合酶（如Polι、Polκ）的交叉反应

4. 浓度标定：A280法，1 mg/mL对应吸光值1.4

5. 缓冲体系：Tris缓冲盐水（TBS）含0.1% BSA作为稳定蛋白，0.09%叠氮化钠作为防腐剂

注：本品浓度较低（200 ?g/mL），但经亲和纯化后特异性高，推荐稀释倍数在WB中可达1:2,000–1:10,000，IP中需按体积计算用量（30 ?L/mg裂解液）。

适用范围与推荐使用条件

> 重要说明：本抗体经验证适用于免疫沉淀（IP）和Western blot（WB）。所有WB实验采用统一封闭和稀释条件（5%牛奶-TBST，一抗过夜）。

应用技术 推荐使用条件 备注

免疫沉淀（IP） 6 ?g抗体/毫克裂解液 按总蛋白质量计算抗体用量

蛋白质印迹（WB） 1:2,000 – 1:10,000 推荐起始稀释度1:5,000

浓度换算：本品浓度为200 ?g/mL，即0.2 ?g/?L。进行IP时，如需6 ?g抗体/毫克裂解液，则需加入30 ?L抗体原液/毫克裂解液。

Western blot 详细操作指南

以下操作参数已由生产实验室验证并推荐。

标准WB流程（细胞裂解液）

样本制备：

PolH在多种细胞系中表达水平中等偏低（相对于管家蛋白），建议使用含蛋白酶抑制剂的RIPA或NP-40裂解液提取总蛋白

蛋白浓度定量后，加入SDS上样缓冲液（含DTT或β-巯基乙醇），95°C煮沸5–10分钟

注意：PolH表达具有细胞周期依赖性（在S期较高），且受DNA损伤诱导（如紫外线处理）。推荐使用UV处理（10–20 J/m?，6–12小时恢复）或使用已知高表达PolH的细胞系以增强信号

凝胶电泳：

PolH分子量约78 kDa（实际预测78.3 kDa）

推荐使用8–10% SDS-PAGE分离胶，可清晰分离PolH条带

上样量：细胞裂解液建议40–60 ?g总蛋白/泳道（因表达水平较低，可能需要较大上样量）

转膜：

PVDF膜（需甲醇活化）或硝酸纤维素膜

湿转条件：恒流250–300 mA，冰浴转膜90分钟；或4°C过夜转膜（25–30 V）

转膜后可用丽春红染色确认转膜效率

封闭（生产实验室参数）：

封闭液：5% 脱脂牛奶-TBST

封闭条件：室温摇床1小时

一抗孵育（生产实验室参数）：

稀释液：5% 脱脂牛奶-TBST

稀释度：1:2,000 – 1:10,000（推荐起始1:5,000；若信号弱可降至1:2,000）

孵育条件：4°C过夜（强烈推荐，低丰度蛋白需延长孵育时间）

洗涤：

TBST洗涤3次，每次10分钟

二抗孵育：

二抗：山羊抗兔IgG（重链+轻链）HRP偶联抗体，货号 A120-101P（或其他等效产品）

稀释度：按厂商推荐（通常1:5,000–1:20,000），使用5%牛奶-TBST稀释

孵育条件：室温1小时

洗涤：TBST洗涤3–5次，每次10分钟

检测：

化学发光法（ECL），建议使用高灵敏度ECL底物（如SuperSignal West Femto、Pierce ECL Plus），因PolH表达丰度较低，常规ECL可能信号不足

曝光时间：初次尝试可曝光30秒、1分钟、5分钟，根据信号强度调整

免疫沉淀后Western blot的特殊要求

当本抗体用于免疫沉淀实验，随后对免疫沉淀复合物进行Western blot检测时，洗脱产物中包含用于IP的抗体（兔IgG）的重链（约55 kDa）和轻链（约25 kDa）。PolH分子量约78 kDa，介于重链（55 kDa）和轻链（25 kDa）之间，但重链55 kDa与PolH 78 kDa有一定距离，通常常规IP-WB使用抗兔H+L二抗产生的重链信号不会直接覆盖PolH条带。然而，如果检测PolH的修饰形式或互作蛋白分子量接近55 kDa，则可能产生干扰。

优化方案（生产实验室推荐，尤其适用于多重检测或高灵敏度需求）：

1. 二抗选择：使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体（仅识别兔IgG轻链，不识别重链）

2. 封闭缓冲液补充：在封闭液中加入5% 正常猪血清（货号 S100-020）

操作步骤（IP-WB）：

完成免疫沉淀后，将洗脱样本煮沸变性，进行SDS-PAGE（8–10%凝胶）

转膜后，封闭液使用含5%正常猪血清的5%牛奶-TBST

一抗孵育：本抗体（1:5,000），用含5%正常猪血清的封闭液稀释，4°C过夜

二抗孵育：抗兔IgG轻链HRP抗体（1:5,000–1:10,000），室温1小时

检测：高灵敏度ECL

储存与稳定性

储存条件：

温度：2–8°C（严禁冷冻，冷冻会导致抗体蛋白变性及活性丧失）

防腐剂：0.09%叠氮化钠

稳定蛋白：0.1% BSA防止低浓度抗体吸附损失

分装建议：本品浓度较低，建议避免频繁开盖，可分装为25–50 ?L/管，仍储存于2–8°C（不建议-20°C）

有效期：自收货之日起12个月。

失效迹象：

出现明显沉淀（BSA可能形成微量沉淀，离心后测试；大量沉淀则废弃）

阳性对照样本（UV处理的HeLa裂解液）WB信号显著下降或消失

IP-WB背景异常升高