兔抗JARID1A/RBP2抗体亲和纯化，高分子量表观遗传靶点检测专用

一、产品概述

本产品由艾美捷Bethyl Laboratories推出，是一款针对人JARID1A/RBP2（即KDM5A）蛋白的高亲和力兔多克隆抗体（货号 A300-897A），经抗原亲和纯化制备。该抗体适用于免疫沉淀（IP）及蛋白质印迹（WB）检测，可同时识别人和小鼠来源的靶蛋白，仅供研究使用。

JARID1A（Jumonji/ARID domain-containing protein 1A），又称RBP2（Retinoblastoma binding protein 2），是含Jumonji结构域的组蛋白去甲基化酶家族成员之一。该家族通过特异性去除组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4）的甲基化修饰，在染色质重塑、转录激活与抑制的平衡调控中发挥关键作用。JARID1A/RBP2可与视网膜母细胞瘤蛋白pRb相互作用，参与细胞周期调控及肿瘤抑制通路。其编码基因KDM5A（赖氨酸特异性去甲基化酶5A）在多种癌症（如胃癌、肺癌、乳腺癌）中异常表达，是表观遗传学研究的热点靶点。

二、产品规格

参数 详细信息

靶标 JARID1A / RBP2 / KDM5A

反应种属 小鼠， 人

应用 IP， WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 完整IgG

免疫原 位于第1640位至C末端之间

同种型 IgG

偶联物 未偶联

纯度 抗原亲和纯化

抗原种属 人

浓度 1000 ?g/mL（1 mg/mL）

缓冲液 Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液，pH 7–8，含0.09%叠氮化钠

储存条件 2–8°C

有效期 自收货之日起1年

三、靶标详细信息

3.1 基因与蛋白信息

Gene ID：5927

Gene Symbol：KDM5A

Gene Name：lysine demethylase 5A

UniProt ID：P29375

Protein Name：Lysine-specific demethylase 5A

3.2 别名

JARID1A， RBBP2， RBBP-2， RBP2， retinoblastoma binding protein 2， histone demethylase JARID1A， jumonji/ARID domain-containing protein 1A。

3.3 功能背景

JARID1A/RBP2是含Jumonji结构域的组蛋白去甲基化酶家族中最早被鉴定的成员之一。该家族成员（包括JARID1A、JARID1C、JMJD1A、JMJD1B、JMJD1C、JMJD2A、JMJD2C及JMJD2D）均依赖铁离子和α-酮戊二酸作为辅因子。JARID1A/RBP2特异性催化组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4me3/me2）的去甲基化，从而抑制下游基因转录。其重要的生物学功能包括：

与pRb相互作用：通过与肿瘤抑制蛋白视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）结合，参与pRb介导的细胞周期负调控。

染色质调控：在发育、分化及肿瘤发生过程中，动态调节靶基因启动子区的H3K4甲基化水平。

癌症相关性：在多种实体瘤中过表达，促进细胞增殖和耐药性，成为潜在的抗癌靶点。

四、抗体制备与纯化

4.1 免疫原及表位定位

本抗体采用的免疫原对应人JARID1A/RBP2蛋白序列中第1640位至C末端之间的区域。经精确定位，A300-897A所识别的表位位于第1640–1690氨基酸区间（参考序列NP_001036068.1）。该区域位于蛋白的C端结构域，远离Jumonji催化核心区，有助于特异性识别全长蛋白而不干扰酶活性检测。

4.2 纯化方法

抗体通过抗原亲和层析纯化。将针对JARID1A/RBP2第1640–1690位表位的特异性多肽固定于固相载体，使抗血清中的特异性IgG结合于该表位，经洗脱获得高纯度抗体。此法确保最终产品中只保留识别目标表位的抗体分子，显著降低非特异性背景，尤其适合需要低背景的IP-WB联用实验。

4.3 浓度测定

免疫球蛋白浓度采用比尔定律测定，以1 mg/mL IgG在280 nm波长下的吸光度（A280）为1.4作为标准。实测浓度为1000 ?g/mL，该批次抗体可直接用于后续稀释，无需额外浓缩。

4.4 缓冲液与防腐剂

抗体储存于Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 7–8），其中含0.09%叠氮化钠作为防腐剂。注意：叠氮化钠有毒，操作时请佩戴防护手套。若用于需要叠氮化物敏感的酶学实验或细胞培养体系，请使用前通过透析或超滤去除。

五、储存与稳定性

收到产品后，请将抗体置于2–8°C条件下储存。切勿冷冻，反复冻融会导致抗体变性聚集、效价下降。在推荐的储存条件下，自收货之日起1年内可保持稳定。若需长期保存，可分装后冻存于-20°C或-80°C，但分装时应避免稀释（高浓度抗体抗冻能力较强），且每份建议一次用完，避免反复冻融。

六、应用指南

以下推荐条件均经过实验验证，用户可根据具体实验体系进行优化。所有WB实验的封闭及抗体稀释均使用5%脱脂奶粉-TBST缓冲液，一抗孵育推荐4°C过夜。

6.1 蛋白质印迹（Western Blot， WB）

推荐稀释比：1:2000 – 1:10000

样本要求：人（如HeLa、293T）或小鼠（如NIH/3T3）细胞裂解液

-凝胶系统：由于JARID1A/RBP2分子量约180–200 kDa（具体取决于剪接变体），建议使用6–8% SDS-PAGE凝胶或梯度凝胶（4–12% Bis-Tris），以保证高分子量蛋白的有效分离和转移。

转膜条件：建议湿转，恒压100V转膜90–120分钟，或恒流300 mA转膜2小时。PVDF膜（甲醇活化）优于NC膜。

6.2 免疫沉淀（Immunoprecipitation， IP）

推荐用量：每毫克细胞裂解液总蛋白使用6 ?g抗体。

例如：若裂解液蛋白浓度为2 mg/mL，取500 ?L（含1 mg总蛋白）进行IP，则加入6 ?g抗体。

操作建议：

1. 裂解液选择：推荐使用非变性裂解缓冲液（如含0.5% NP-40或Triton X-100，50 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，加蛋白酶抑制剂）。

2. 预清除：裂解液与蛋白A/G琼脂糖珠或磁珠4°C孵育30–60分钟，离心取上清，减少非特异性结合。

3. 抗体结合：加入6 ?g抗体，4°C旋转孵育2–4小时或过夜。

4. 捕获：加入20–30 ?L蛋白A/G珠悬液，继续4°C孵育1–2小时。

5. 洗涤：用裂解缓冲液洗涤沉淀3–5次，每次5分钟，4°C旋转。

6. 洗脱：加入2× SDS上样缓冲液，95°C加热5–10分钟，离心取上清进行WB。

注意事项：JARID1A/RBP2在细胞中表达丰度中等，建议起始裂解液总蛋白不少于800 ?g。若IP产物WB信号弱，可增加抗体用量至8–10 ?g/mg裂解液，或延长抗体结合时间。

6.3 跨种属反应性说明

本经验证可识别人（human）和小鼠（mouse）的JARID1A/RBP2蛋白。该跨种属反应性基于表位序列在人和小鼠间的保守性分析（第1640–1690区域同源性大于85%）。建议在使用小鼠样本时设置已知人细胞系作为阳性对照，以验证实验系统。

七、产品特点总结

1. 双重种属反应性：同时识别人和小鼠JARID1A/RBP2，扩大应用范围。

2. 精确定位的C端表位：抗原亲和纯化基于第1640–1690位氨基酸，避免与其他Jumonji家族成员（如JARID1C）的交叉反应。

3. 高浓度（1 mg/mL）：6 ?g/mg裂解液即可高效IP，节约抗体用量。

4. IP-WB兼容优化：配合轻链特异性二抗及正常猪血清体系，彻底消除免疫球蛋白重/轻链的背景干扰，确保目标条带清晰。

5. 长期稳定性：2–8°C储存1年有效，简化冷链管理。

参考文献（部分）：

Benevolenskaya EV, et al. (2005) *Mol Cell Biol* 25: 5320–5332.

Christensen J, et al. (2007) *Epigenetics* 2: 20–26.

Blair LP, et al. (2011) *J Biol Chem* 286: 35350–35358.