兔抗RPA70抗体亲和纯化，IP推荐仅需6ug/mg裂解物，高效捕获RPA复合物

一、产品概述

本产品为艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗RPA70多克隆抗体（货号：A300-241A），经抗原亲和纯化，以全IgG形式提供，未偶联标记。该抗体特异性识别RPA70蛋白（复制蛋白A 70 kDa亚基，亦称RPA1），反应性涵盖小鼠和人源样本，适用于免疫组织化学（IHC）、免疫沉淀（IP）及免疫印迹（WB）等多种应用。产品浓度为1000 ?g/ml，储存于2-8°C，有效期为收货后一年。

二、产品规格参数

参数 规格

靶点 RPA70（RPA1）

反应性 小鼠、人

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 全IgG

免疫原 人RPA70蛋白第350-400位残基

同型 IgG

偶联物 未偶联

纯度 抗原亲和纯化

抗原种属 人

浓度 1000 ?g/ml

缓冲液 Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH 7-8，含0.09%叠氮化钠

储存温度 2-8°C

有效期 收货后1年

三、推荐应用与实验方法

3.1 免疫印迹（Western Blot, WB）

推荐稀释度：1:2,000 - 1:10,000

3.2 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）

推荐用量：6 ?g/mg裂解物

3.3 免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）

推荐稀释度：1:1,000 - 1:5,000

四、储存与稳定性

储存温度：2-8°C，严禁冷冻。反复冻融会导致抗体变性、聚集和效价下降。

缓冲体系：Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液（pH 7-8），含0.09%叠氮化钠作为防腐剂。

有效期：收货后1年内稳定。建议分装成单次使用量，储存于2-8°C，避免污染。

运输条件：冰袋运输。收到后请立即检查是否浑浊或沉淀。

五、使用注意事项

1. 叠氮化钠影响：缓冲液含0.09%叠氮化钠，对细胞有毒，且抑制HRP活性。若计划进行细胞培养添加实验或对IP产物进行HRP标记检测时无需去除（因WB步骤中叠氮化物被稀释），但若需偶联HRP则必须通过透析或脱盐柱去除。

2. 多克隆抗体批次差异：不同批次间可能存在效价差异，建议对大批量实验预留批次间验证环节。

3. 交叉反应性：已验证对小鼠和人RPA70有反应性。其他种属（如大鼠）预期有交叉反应，但需自行验证。

4. DNA结合特性：RPA70是单链DNA结合蛋白，在制备细胞裂解液时，若不加核酸酶，部分RPA70可能结合在染色质上难以释放。建议裂解后加入Benzonase或DNase I（1-5 ?g/ml，冰上处理15-30分钟）以提高可溶性RPA70的提取效率。

5. 磷酸化状态：DNA损伤（如UV、γ射线、羟基脲处理）后，RPA70被ATM/ATR磷酸化，在WB中表现为约5-10 kDa的迁移滞后（条带上移）。本抗体识别第350-400位区域（不依赖磷酸化），可检测总RPA70，包括磷酸化形式。

6. 稀释度优化：推荐稀释度为一般参考范围，实际最佳稀释度需根据样本类型和实验体系进行梯度预实验确定。WB可从1:5,000开始，IHC从1:2,000开始。

六、典型实验流程示例（WB快速方案）

准备工作：

制备RPA70表达阳性的细胞裂解液（推荐：HeLa、HEK293T、NIH3T3细胞）

阳性对照：经DNA损伤处理（如10 Gy γ射线或50 J/m? UV后修复1-2小时）的细胞裂解液可检测磷酸化迁移条带

步骤：

1. 取30-50 ?g蛋白/孔，进行SDS-PAGE（10%分离胶）

2. 转膜至PVDF或硝酸纤维素膜（常规湿转：100 V，60-75分钟）

3. 封闭：5% Milk-TBST室温1小时

4. 一抗：1:5,000稀释于5% Milk-TBST，4°C摇床孵育过夜

5. 洗涤：TBST洗涤3次，每次10分钟

6. 二抗：山羊抗兔HRP二抗（1:10,000）于5% Milk-TBST，室温1小时

7. 洗涤：TBST洗涤4次，每次10分钟

8. ECL化学发光显影，曝光观察约70 kDa条带

预期结果：

在未处理细胞裂解液中可见约70 kDa的清晰单一条带

在DNA损伤处理细胞中，可见分子量略高的磷酸化条带（迁移滞后）或双条带

若进行siRNA敲低RPA1，条带强度应显著减弱

七、相关产品推荐

山羊抗兔IgG（H+L） A120-101P WB二抗

抗兔IgG轻链HRP偶联物 - IP-WB检测，避免重链干扰

正常猪血清 S100-020 IP-WB封闭添加物

RPA70阳性对照裂解液（HeLa） 自制或市售 WB/IHC阳性对照

Tris-EDTA抗原修复液（pH 9.0） - IHC修复

Protein A/G琼脂糖珠 - IP实验

Benzonase或DNase I 市售 裂解液中降解DNA，释放RPA70

*本技术资料基于产品说明书（克隆号A300-241A等）及UniProt注释编制，具体实验条件请研究者结合样本类型和实验室平台进行优化。