兔抗Paf1多克隆抗体，低背景高信噪比，助力IP-WB联合应用

Paf1（RNA聚合酶相关因子1，也称PD2）是真核生物Paf1复合物的核心亚基之一。该复合物最早在酵母中发现并与RNA聚合酶II（RNAP II）相互作用，在转录延伸、组蛋白H2B单泛素化、H3甲基化、染色质重塑以及mRNA 3’端加工等多个基因表达调控环节发挥关键作用。哺乳动物Paf1复合物参与细胞增殖、分化及肿瘤发生，其中Paf1本身在胰腺癌等多种恶性肿瘤中高表达，被视为潜在的治疗靶点。因此，准确检测Paf1的表达水平、结合蛋白及细胞内定位，对于转录调控和肿瘤机制研究至关重要。

本文所介绍的由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗Paf1多克隆抗体（货号：A300-172A）是针对人Paf1蛋白第75–125位氨基酸区域的特异性抗体，经抗原亲和纯化，适用于免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB），可识别人和小鼠来源的Paf1。以下从抗体规格、生产纯化、实验应用及性能特征等方面进行详细说明。

一、抗体核心规格

项目 | 具体参数

靶标 | Paf1（PAF1 homolog, Paf1/RNA polymerase II complex component）

反应性 | 小鼠、人

应用 | IP, WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 全分子IgG

免疫原 | 人Paf1第75–125位氨基酸之间的区域

亚型 | IgG

标记 | 未偶联

纯度 | 抗原亲和纯化

抗原种属 | 人

浓度 | 1000 ?g/ml（1 mg/ml）

缓冲液 | Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液，pH 7–8，含0.09%叠氮钠

储存条件 | 2–8 °C

有效期 | 收货后1年

浓度测定方法 | Beer’s Law（A280 1.4对应1 mg/ml IgG）

抗体浓度：1 mg/ml的高浓度设计，满足IP实验需要较大抗体量（6 ?g/mg裂解液）以及WB中宽范围稀释（1:2000–1:10000）的需求。

防腐剂：含0.09%叠氮钠，可抑制微生物生长。常规IP/WB实验不受影响；如需用于活细胞或体内实验，需通过透析去除。

二、生产与纯化工艺

1. 免疫原设计

选择人Paf1蛋白序列（TrEMBL Q9NUU9，GeneID 54623）中第75–125位氨基酸之间的合成肽段作为免疫原。该区域位于蛋白质N端附近，在人和小鼠中高度保守，因此抗体可同时检测两种种属。此外，该表位不参与已知的蛋白质-蛋白质相互作用界面，有利于识别天然和变性状态的Paf1。

2. 抗血清制备

采用上述免疫原免疫兔，获得高滴度多克隆抗血清。

3. 亲和纯化

将免疫原肽段共价偶联到固相支持物（如琼脂糖凝胶）上形成亲和层析柱。抗血清通过该柱时，特异性识别该表位的抗体被捕获，经低pH洗脱后得到高纯度、高活性的全分子IgG。此过程去除了不识别靶表位的非特异性免疫球蛋白，显著降低背景。

4. 浓度与缓冲液

纯化后的抗体溶于Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 7–8），并加入0.09%叠氮钠作为防腐剂。该缓冲体系不含EDTA或高浓度盐，适合直接用于IP和WB稀释。

特异性验证：通过肽段竞争ELISA确认抗体仅识别Paf1第75–125表位，与全长蛋白的其他区域无交叉。敲低实验（siRNA靶向PAF1）可导致WB中目标条带消失，进一步验证特异性。

三、推荐应用与实验条件

本抗体已验证适用于免疫沉淀和免疫印迹。以下为厂家推荐的实验条件及操作要点。

1. 免疫沉淀（IP）

使用量：6 ?g 抗体 / mg 细胞裂解液总蛋白。

例如：取1 mg总蛋白裂解液，加入6 ?l本抗体（浓度1 mg/ml，即6 ?l含6 ?g抗体）。

裂解液选择：推荐使用非变性裂解液，如含0.5% NP-40或0.5% Triton X-100的Tris缓冲液（pH 7.5），并添加蛋白酶抑制剂（如PMSF、cocktail）。避免使用强变性剂（如SDS）以免破坏Paf1复合物的天然构象。

操作流程：

1. 将裂解液与抗体在4°C旋转孵育2小时或过夜。

2. 加入40–50 ?l Protein A琼脂糖珠（预平衡），继续孵育1–2小时。

3. 离心（2000×g，1分钟）收集珠子，用裂解液洗涤3–5次。

4. 加入2× SDS上样缓冲液（含还原剂），95°C加热5分钟，离心后取上清进行WB检测。

阳性对照：人HeLa、293T细胞裂解液或小鼠NIH/3T3细胞裂解液。Paf1在多种细胞系中普遍表达，预期分子量约60–70 kDa（实际大小因物种和修饰略有差异）。

2. Western Blot（WB）

稀释范围：1:2000 – 1:10,000

封闭与稀释液：5%脱脂牛奶 – TBST（Tris缓冲盐水含0.1% Tween-20）。厂家指定使用5% Milk-TBST作为封闭液和抗体稀释液，不可替换为BSA或其他成分（可能影响信号强度）。

一抗孵育：4°C孵育过夜。室温短时间孵育可能导致灵敏度下降，建议严格遵循过夜条件。

二抗选择：

检测全细胞裂解液：使用山羊抗兔IgG（H+L）HRP标记抗体（如货号A120-101P），稀释度通常为1:5000–1:10000。

检测免疫沉淀产物：由于IP使用兔抗体，其重链（~55 kDa）和轻链（~25 kDa）会在WB中显影，可能与目标蛋白Paf1（~65 kDa）或普通IgG轻链带重叠。为此，厂家建议使用抗兔IgG轻链特异性HRP标记抗体（可避免重链交叉），并在封闭液中加入5%正常猪血清（货号S100-020）以降低背景。轻链抗体仅识别约25 kDa的轻链，因此不会干扰60–70 kDa目标区域的检测。

阳性对照：HeLa或293T全细胞裂解液，上样量20–50 ?g总蛋白。

3. 实验注意事项

样本制备：使用含SDS和还原剂（如DTT或β-巯基乙醇）的上样缓冲液，95°C加热5分钟。

膜类型：推荐使用PVDF膜（需甲醇活化）或硝酸纤维素膜。转膜后可用丽春红染色确认转印效果。

洗涤：TBST洗涤3次，每次5分钟，确保去除未结合抗体。

四、储存稳定性

2–8°C条件下可稳定保存1年。请勿冷冻，冷冻会导致抗体聚集和效价下降。如必须长期保存，可分装后于-80°C冻存（官方未验证此条件，但许多用户成功使用；注意避免反复冻融）。