兔抗纤维蛋白原抗体亲和纯化，突破石蜡切片检测壁垒

Parafibromin（又称CDC73、HRPT2）是一种由CDC73基因编码的肿瘤抑制蛋白，主要作为PAF1复合物的核心组分，与RNA聚合酶II相互作用，参与转录延伸及mRNA 3’端加工过程。研究表明，Parafibromin还直接调控细胞周期，其功能丧失与甲状旁腺功能亢进-颌骨肿瘤综合征（HPT-JT）、家族性孤立性甲状旁腺功能亢进（FIHP）以及多种散发性甲状旁腺癌、肾癌和乳腺癌密切相关。因此，对Parafibromin的表达水平、结合蛋白及亚细胞定位进行准确检测，对于肿瘤发生机制研究和临床病理评估具有重要意义。

本文所介绍的由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗Parafibromin多克隆抗体（货号：A300-170A）是针对人Parafibromin蛋白第250–300位氨基酸区域的特异性抗体，经抗原亲和纯化，适用于免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB），可识别人和小鼠来源的Parafibromin。以下从抗体规格、生产纯化、实验应用及性能特征等方面进行详细说明。

一、抗体核心规格

项目 | 具体参数

靶标 | Parafibromin（CDC73）

反应性 | 小鼠、人

应用 | IP, WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 全分子IgG

免疫原 | 人Parafibromin第250–300位氨基酸之间的区域

亚型 | IgG

标记 | 未偶联

纯度 | 抗原亲和纯化

抗原种属 | 人

浓度 | 1000 ?g/ml（1 mg/ml）

缓冲液 | Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液，pH 7–8，含0.09%叠氮钠

储存条件 | 2–8 °C

有效期 | 收货后1年

浓度测定方法 | Beer’s Law（A280 1.4对应1 mg/ml IgG）

抗体浓度说明：本产品浓度为1000 ?g/ml（即1 mg/ml），属于高浓度抗体，适合需要大量抗体的IP实验以及高稀释比（1:5000–1:20000）的WB实验。

防腐剂：含0.09%叠氮钠，可抑制微生物生长。如需用于活细胞或体内实验，请通过透析去除叠氮钠；常规WB/IP（使用已裂解样本）不受影响。

二、生产与纯化工艺

1. 免疫原设计  

选择人Parafibromin蛋白序列（TrEMBL Q6P1J9）中第250–300位氨基酸之间的合成肽段作为免疫原。该区域位于蛋白质中央功能域附近，在人和小鼠中高度保守，因此抗体可同时检测两种种属。

2. 抗血清制备  

采用该免疫原免疫兔，获得高滴度多克隆抗血清。

3. 亲和纯化  

将免疫原肽段共价偶联到固相支持物（如琼脂糖凝胶）上，形成亲和层析柱。抗血清通过该柱时，特异性识别该表位的抗体被捕获，经洗脱后得到高纯度、高活性的全分子IgG。

4. 浓度与缓冲液  

纯化后的抗体溶于Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液（pH 7–8），并加入0.09%叠氮钠作为防腐剂。该缓冲体系不含EDTA或其他干扰免疫沉淀的螯合剂，可直接用于IP和WB稀释。

特异性验证：通过肽段竞争ELISA确认抗体仅识别Parafibromin第250–300表位，与全长蛋白的其它区域无交叉。由于该区域并非在PAF1复合物中与其他蛋白相互作用的界面，故抗体可有效识别天然构象和变性后的Parafibromin。

三、推荐应用与实验条件

本抗体已验证适用于免疫沉淀和免疫印迹。以下为厂家推荐的实验条件及操作要点。

1. 免疫沉淀（IP）

使用量：6 ?g 抗体 / mg 细胞裂解液总蛋白。

例如：取1 mg总蛋白裂解液，加入6 ?l本抗体（因为浓度1 mg/ml，即6 ?l含6 ?g抗体）。

裂解液选择：推荐使用非变性裂解液（如RIPA缓冲液或含0.5% NP-40、0.5% Triton X-100的Tris缓冲液），并添加蛋白酶抑制剂（如PMSF、cocktail）。

操作流程：

1. 将裂解液与抗体在4°C旋转孵育2小时或过夜。

2. 加入40–50 ?l Protein A/G琼脂糖珠（预平衡），继续孵育1–2小时。

3. 离心收集珠子，用裂解液洗涤3–5次。

4. 加入2× SDS上样缓冲液，95°C加热5分钟，离心后取上清进行WB检测。

阳性对照：人HeLa细胞裂解液、293T细胞裂解液或小鼠NIH/3T3细胞裂解液。Parafibromin在多种细胞系中普遍表达。

2. Western Blot（WB）

稀释范围：1:5000 – 1:20,000

封闭与稀释液：5%脱脂牛奶 – TBST（Tris缓冲盐水含0.1% Tween-20）。厂家指定使用5% Milk-TBST作为封闭液和抗体稀释液。

一抗孵育：4°C孵育过夜（厂家推荐条件）。室温短时间孵育可能导致信号减弱，建议严格遵循过夜条件。

二抗选择：

检测全细胞裂解液：使用山羊抗兔IgG（H+L）HRP标记抗体（如货号A120-101P）。

检测免疫沉淀产物：由于IP使用兔抗体，其重链（~55 kDa）和轻链（~25 kDa）会在WB中显影，可能与目标蛋白（Parafibromin分子量约70 kDa）或普通IgG轻链带（~25 kDa）重叠。为此，厂家建议使用抗兔IgG轻链特异性HRP标记抗体（可避免重链交叉），并在封闭液中加入5%正常猪血清（货号S100-020）以降低背景。

阳性对照：HeLa或293T全细胞裂解液，上样量20–50 ?g总蛋白。目标蛋白预期分子量约60–70 kDa（实际观察可能有微小差异，取决于翻译后修饰）。

3. 实验注意事项

样本制备：使用含SDS和还原剂的变性上样缓冲液，95°C加热5分钟。建议同时上样未诱导或敲低的阴性对照。

膜类型：推荐使用PVDF或硝酸纤维素膜。转膜后可用丽春红染色确认转印效率。

洗涤：TBST洗涤3次，每次5分钟。

四、储存稳定性  

2–8°C条件下可稳定保存1年。请勿冷冻，冷冻会导致抗体聚集和效价下降。如必须长期保存，可分装后于-80°C冻存（官方未验证此条件，但许多用户成功使用；注意避免反复冻融）。