FBXL10均相检测试剂盒：基于AlphaLISA技术的组蛋白去甲基化酶活性筛选工具

FBXL10（F-box and leucine-rich repeat protein 10），又称KDM2B、JHDM1B或CXXC2，是一种组蛋白赖氨酸去甲基化酶，能够特异性催化组蛋白H3第4位三甲基赖氨酸（H3K4me3）和第36位二甲基赖氨酸（H3K36me2）的去甲基化反应。作为多梳抑制复合物（PRC）的组成部分，FBXL10在细胞增殖、分化和迁移中发挥关键调控作用。研究表明，FBXL10在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中具有致癌活性，但在某些细胞类型中又表现为肿瘤抑制功能，提示其作用具有细胞类型依赖性。深入解析FBXL10的生物学功能及其在癌症发生发展中的双重角色，将为肿瘤治疗提供新靶点和新策略。

为满足科研人员在FBXL10酶活性检测、抑制剂筛选及药物发现中的需求，由艾美捷代理BPS Bioscience公司推出的FBXL10 (KDM2B) 均相检测试剂盒（货号：50610）提供了一套基于AlphaLISA技术的高灵敏度、高通量兼容的解决方案。该试剂盒以96孔或384孔板格式提供，包含纯化的重组FBXL10酶、特异性抗体、生物素化底物及优化缓冲液，支持100次或400次酶反应，适用于酶动力学研究及小分子抑制剂的高通量筛选（HTS）。

图1：FBXL10（KDM2B）均相检测试剂盒原理。

首先，将含有FBXL10酶的样本与生物素化底物一起孵育。接着，加入受体珠和一抗，然后加入供体珠。α计数与去甲基酶活性成正比。

一、检测原理：基于AlphaLISA的均相免洗技术

本试剂盒采用AlphaLISA（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay） 技术，这是一种基于化学发光的均相检测方法，无需洗涤步骤，具有极高的灵敏度和宽广的动态范围。

检测流程分为两个关键步骤：

第一步：酶催化去甲基化反应。 将重组FBXL10酶与生物素化组蛋白H3肽底物（含H3K4me3或H3K36me2修饰）共同孵育。在酶活性存在下，底物上的甲基被移除，产生去甲基化的肽产物。

第二步：AlphaLISA信号检测。 反应结束后，依次加入：

兔源一抗：特异性识别去甲基化后的表位（即仅在甲基被移除后暴露的抗原表位）。

AlphaLISA Anti-Rabbit IgG Acceptor Beads（受体微球）：偶联有抗兔IgG抗体。

AlphaScreen Streptavidin Donor Beads（供体微球）：通过链霉亲和素与生物素化底物结合。

当底物被FBXL10去甲基化后，一抗与去甲基化表位结合，进而通过二抗将受体微球招募至同一复合物。此时，供体微球（结合于底物的生物素端）与受体微球（结合于抗体端）在空间上相互靠近。在680 nm激光激发下，供体微球产生单线态氧；若两种微球距离小于200 nm，单线态氧可传递至受体微球，触发其发出615 nm的化学发光信号。发光强度与FBXL10的去甲基化酶活性成正比。若化合物抑制FBXL10活性，去甲基化产物减少，一抗无法结合，受体微球不能被招募，信号降低。

关键优势：AlphaLISA技术无需洗涤，操作简单（“加样-混合-孵育-读数”），背景极低，灵敏度可达fmol级，动态范围超过4个数量级，完美兼容自动化高通量筛选。

二、试剂盒核心组分与设计优势

1. 即用型完整组分（需自购Alpha微球）

试剂盒提供以下核心组分（注意：AlphaLISA受体微球和AlphaScreen供体微球需单独向PerkinElmer购买）：

纯化的重组人FBXL10（KDM2B）酶：保留完整去甲基化酶活性。

生物素化组蛋白H3肽底物：含特定甲基化修饰（H3K4me3或H3K36me2）。

兔源一抗：特异性识别去甲基化表位。

10× 检测缓冲液：优化pH和离子组成，确保酶反应及AlphaLISA信号稳定。

微孔板：可选OptiPlate-96或OptiPlate-384（PerkinElmer）。

2. 96孔/384孔双规格，灵活适配不同通量

该试剂盒提供96孔（100次酶反应）和384孔（400次酶反应）两种规格，用户可根据实验规模灵活选择：

96孔规格：适合常规实验、方法开发及中小规模抑制剂筛选。

384孔规格：适合高通量筛选（HTS），单位反应成本更低，与自动化移液工作站完美兼容。

3. 内置对照（建议自行配置）

虽然试剂盒本身未提供阳性对照抑制剂，但研究人员可使用已知的组蛋白去甲基化酶抑制剂（如CPI-455，针对KDM5家族，但对FBXL10有参考价值）或自行验证的化合物作为阳性对照。建议在每次实验中设置无酶对照（背景信号）和无抑制剂对照（最大信号），以确保数据的可靠性。

三、应用场景与科研价值

1. FBXL10抑制剂的高通量筛选

FBXL10在DLBCL、胶质瘤等多种肿瘤中高表达，其去甲基化酶活性促进肿瘤细胞增殖和迁移。利用该试剂盒，研究人员可以：

在96孔或384孔板中快速筛选数千个化合物，评估其对FBXL10去甲基化酶活性的抑制效果。

通过剂量-反应曲线测定IC50值，比较不同化合物的抑制效力。

筛选FBXL10选择性抑制剂（与其他KDM家族成员进行正交筛选），为开发靶向FBXL10的抗肿瘤药物提供先导化合物。

2. 酶动力学研究

利用试剂盒中的纯化重组酶和生物素化底物，研究人员可以：

通过改变底物浓度，测定FBXL10的米氏常数（Km）及最大反应速率（Vmax）。

分析不同突变体（如与癌症相关的FBXL10突变）对酶活性的影响。

研究FBXL10与其他PRC复合物组分（如RING1B、BMI1）相互作用对酶活性的调节。

3. 构效关系（SAR）研究

在药物化学优化阶段，该试剂盒可用于评估系列化合物（如小分子类似物、PROTAC分子）对FBXL10的抑制活性，快速筛选出活性最优的候选化合物，指导药物设计。

4. 表观遗传调控机制研究

FBXL10不仅催化组蛋白去甲基化，还通过其CXXC结构域结合非甲基化CpG岛，参与基因转录调控。利用该试剂盒，研究人员可以定量分析不同细胞状态（如分化、应激、药物处理）下FBXL10的酶活性变化，揭示其在表观遗传调控网络中的功能。

四、操作要点（典型步骤）

1. 准备试剂：将FBXL10酶、生物素化底物、一抗及检测缓冲液从-80°C取出，冰上融化。注意避光保存Alpha微球。

2. 配制反应混合液：根据说明书稀释FBXL10酶至工作浓度。

3. 酶反应：在微孔板中加入检测缓冲液、待测化合物（或抑制剂）、FBXL10酶和生物素化底物，混匀后37°C孵育60-120分钟。

4. 一抗结合：加入兔源一抗，室温孵育30-60分钟。

5. Alpha微球加入：在避光条件下加入AlphaLISA受体微球和AlphaScreen供体微球（需预先稀释至工作浓度），室温避光孵育30-60分钟。

6. 读数：使用AlphaScreen兼容的荧光微孔板读数仪，在680 nm激发波长下检测615 nm发射光强度。

7. 数据分析：计算抑制率 =（1 - 样品信号值 / 无抑制剂对照信号值）× 100%，使用非线性回归拟合IC50曲线。

五、文献参考

Iwase S., et al., 2007 Cell 128(6):1077-1088.

Zhao X., et al., 2018 Cell Death Dis. 9(2):46.