生物活性研究必备：可溶性环氧化物水解酶抑制剂筛选试剂盒

哺乳动物可溶性环氧化物水解酶（SEH）是a/β-水解酶折叠家族的成员，催化外源和内源环氧化物水解为邻位二醇。SEH是由两个结构域组成的同二聚体。C末端结构域负责环氧化物水解酶活性，而N末端结构域具有磷酸酶活性的催化中心。sEH的内源性底物包括环氧二十碳三烯酸（EETs），它具有血管舒张和抗炎活性。抑制sEHin动物模型已被证明能有效治疗高血压和血管炎症以及相关综合征。?这些研究证明了靶向sEH开发小分子抑制剂作为治疗剂的价值。

Cayman的基于荧光的sEH抑制剂筛选试剂盒为筛选人环氧化物水解酶抑制剂提供了一种简便的方法。该方法利用（3-苯基-氧杂环烷基）-乙酸氰基-（6-甲氧基-萘-2-yl）-甲酯（PHOME）作为底物。当PHOME的环氧基被环氧化物水解酶水解时，发生分子内环化，导致在碱性条件下释放氰醇。氰醇迅速分解为氰离子和高度荧光的6-甲氧基-2-萘甲醛，可以在330 nm的激发波长和465 nm的发射波长下进行分析。

特点：

sEH抑制剂筛选

检测45个样本，一式两份

基于平板的荧光测量（例如330 nm，em 465 nm）

需要但未提供的材料：

1.一种荧光计，能够分别使用330和465nm的激发和发射波长测量荧光

2.可调式移液器和重复移液器

3.超纯水来源（Milli-Qor HPLC级水）

实验前准备：

注意：用于准备所有试剂和缓冲液的水必须经过去离子处理。玻璃蒸馏水、HPLC级水和无菌水（用于注射）适用于本试剂盒。可以从Cayman购买UltraPure水（项目编号400000）。

试剂准备：

1. SEH测定缓冲液（10X）

将3毫升的SEH测定缓冲液（10X）浓缩液（项目编号600036）用27毫升的HPLC级水稀释。最终的测定缓冲液，25mM双Tris，pH 7.0，应用于测定和稀释环氧水解酶。如果储存在-20℃，这种稀释后的测定缓冲液至少稳定六个月。

2. sEH（人重组）

每个小瓶（项目编号600037）含有12μl的人重组sEH。在冰上解冻酶。在测定前，直接向一个酶小瓶中加入588μl的冷测定缓冲液。这足够用于整个96孔板的酶。如果不使用整个板，根据需要相应调整稀释酶的量，使用前将酶用冷测定缓冲液稀释1:50。稀释后的酶在冰上稳定四小时。准备剩余未稀释酶的小份，并储存在-80℃。

3. sEH底物

小瓶（项目编号600038）含有600μl的10μM PHOME溶液，溶于二甲基亚砜（DMSO）。底物已准备好，可以直接使用。底物的最终浓度为0.25μM，低于估计的Km值1.5μM。对于竞争性抑制剂，IC50取决于底物浓度，并应在发表实验结果时报告。

移液提示：

- 使用不同的枪头来移液缓冲液、底物、抑制剂和蛋白质。

- 在移液每种试剂之前，先将移液器枪头在该试剂中平衡（即，缓慢充满枪头并轻轻排出内容物，重复几次）。

- 不要将移液器枪头暴露在已经在孔中的试剂中。

一般信息：

- 所有孔的测定最终体积为200μl。

- 没有必要一次使用板上的所有孔。

- 测定温度为25℃。在测定前将测定缓冲液和底物预热至室温。

- 可能需要在几个浓度下测定抑制剂以确定有效浓度。

- 如果使用DMSO作为溶剂，建议所有稀释都在玻璃瓶中进行。使用塑料瓶可能会导致生物活性污染物的溶出，这可能会干扰测定。

- 我们建议将样品进行三次重复测定，但是否这样做取决于用户的决定。

- 可以在三次重复中测定三十个抑制剂样品，或者在两次重复中测定四十五个样品。

分析计算：

1. 确定背景孔的平均荧光（AF）、100%初始活性孔和每个抑制剂的平均荧光。

2. 从100%初始活性和抑制剂AF中减去背景AF。

3. 使用以下公式计算剩余的百分比活性：

4. 如果测试了初始抑制的多种浓度，请将百分比活性作为抑制剂浓度的函数绘制成图，以确定IC50值（抑制50%的浓度）。

精度：

批内变异系数=7.0%（n=12）。批间变异系数=7%（n=5）。

图.AUDA对人重组sEH的抑制作用（IC₅₀=1nM）

文献参考：

1.Chiamvimonvat,N.,Ho,C.-M.,Tsai,H.-J.,et al.The soluble epoxide hydrolaseas a pharmaceutical target for hypertension.J.Cardiovasc.Pharmacol.50(3),225-237(2007).

2.Yu,Z.,Xu,F.,Huse,LM.,et al.Soluble epoxide hydrolase regulates hydrolysisof vasoactive epoxyeicosatrienoic acids.Circ.Res.87,992-998(2000).

3.Imig,J.D.,Zhao,X.,Zaharis,C.Z.,et al.An orally active epoxide hydrolaseinhibitor lowers blood pressure and provides renal protection insalt-sensitive hypertension.Hypertension 46(2),975-981(2005).

4.Wolf,N.M.,Morisseau,C.,Jones,P.D.,et al.Development of ahigh-throughput screen for soluble epoxide hydrolase inhibition.Anal.Biochem.355,71-80(2006).