Hycult：人替代途径补体活性试验

补体活性的测定用于识别补体系统是否在体内受到影响，并在补体治疗时代用于监测和筛选补体抑制剂的功能。历史上使用的溶血试验由于调理作用、红细胞的稳定性以及复杂的耗时步骤难以标准化。基于ELISA的试验可以克服这一点，但可能会受到高血清稀释度和限制性定量的阻碍。替代途径（AP）补体活性试验（货号HK3012）已经开发出来，旨在通过准确、更标准化和高通量的补体活性评估来改进功能性补体测量。

人替代途径补体活性试验（货号HK3012）在体外测量血清中的补体功能。试验的孔用脂多糖（LPS）包被，当补体级联反应完成后，通过C9新表位抗体检测体外形成的膜攻击复合物（MAC）复合物。

功能替代途径检测的示意图：

补体激活的定量分析:

(a-d) 对经过对数转换的吸光度（OD）值进行回归分析。通路活性以校准品活性的百分比表示。  

(a) 校准血清和供体血清的OD值。  

(b) 确定最大OD值，并省略具有相似OD值或更高OD值的稀释度。  

(c) 将OD值转换到0和1之间，随后使用公式y’=ln[y/(1-y)]对值进行对数转换。  

(d) 对数据点应用线性回归分析。

最佳样本稀释与定量：

最佳血清稀释度是通过测试不同血清供体的关键点稀释度来确定的。在关键点稀释度（7.5倍，见上图）时，所有补体成分均不受限制，且替代途径的活性达到100%。超过关键点的稀释度可用于定量测量样本的补体活性，与由保存的混合血清组成的校准品进行比较。如果出现异常活性水平，只要关键点稀释度已经验证，可以测试其他稀释度。

结论：

通过对100名健康血清供体的队列研究发现，替代途径活性呈正态分布（见下图）。大多数供体的通路活性与校准品相比为100%-200%。

Hycult Biotech开发了一种易于使用且标准化的替代途径补体活性检测方法（货号HK3012），能够实现可重复且定量的补体检测，用于筛选补体治疗药物。该检测方法能够在低血清稀释度（7.5倍至38倍稀释）下测量补体活性，从而降低假阴性结果的可能性。

样本处理：

对四种不同样本的台面稳定性和冻融稳定性进行了测定。如果替代途径（AP）活性的回收率在80%-120%之间，则认为样本是稳定的。样本在室温下放置16小时或在冰上过夜（O/N）后仍保持稳定。此外，样本在经过四次冻融循环后也保持稳定。尽管如此，仍建议尽量减少冻融循环次数，并将样本保存在冰上，以防止补体激活。

批内和批间差异：

通过在12次实验中使用三个相同的样本对试验的可重复性进行了测试。批内变异和批间变异分别满足变异系数（CV%）小于15%和小于20%的要求（见下表），这意味着替代途径（AP）试验是可重复的。

孵育温度和时间的影响：

通过增加和减少孵育温度和时间来评估试验的稳健性。在40℃孵育时可以获得更高的信号，而降低孵育温度则会完全阻止通路激活（见下图）。补体级联反应依赖于酶活性和复合物的形成，这些在37℃时最为理想。缩短试验流程也是不建议的，因为这会导致补体活性显著降低。

抑制剂检测：

替代途径（AP）试验的一个应用是测试补体抑制剂的效力。一种针对AP特异性的C3抑制剂在AP试验中进行了测试。随着抑制剂浓度的增加，观察到补体活性降低，最终导致替代途径活性完全被阻断。结果（见上图）证实了AP试验适用于筛选新的补体抑制剂。

AP的激活涉及C3的自发水解，与B因子结合形成C3(H2O)Bb转化酶，该转化酶可以通过补体因子P（properdin）稳定。调节则由因子H（fH）和因子I（fI）等蛋白完成。所有途径均产生C3转化酶，将C3分解为主要片段C3b。这些途径在C3b启动第二个转化酶——C5转化酶时汇聚，C5转化酶将C5分解为C5a和C5b，放大补体活性并形成细胞溶解性的膜攻击复合物（MAC）。

补体蛋白评估或补体活性检测有助于识别体内补体系统的异常，并筛选补体抑制剂的功能。传统上使用的溶血试验由于调理作用和红细胞稳定性等复杂因素，难以标准化。基于ELISA的检测方法虽然更具灵活性，但受到血清稀释的挑战。HK3012替代补体途径活性检测方法解决了这些问题，提供了一种标准化的检测方法。随着补体抑制剂成本的增加以及对更有效选项的需求，准确测量补体活性变得至关重要。

HK3012替代补体途径活性检测方法通过使用脂多糖（LPS）包被的孔来检测体外形成的膜攻击复合物（MAC）复合物，使用C9新表位抗体进行检测，从而在体外评估补体功能。该检测从7.5倍的血清稀释开始，并使用特定缓冲液防止不同途径之间的干扰。通过1.5倍稀释结合回归分析，能够准确测量补体活性和抑制能力。