YF-S0疫苗：单剂接种10天即获保护，ELISpot揭秘Th1免疫优势

COVID-19大流行迫切需要安全、高效且快速起效的疫苗。传统灭活疫苗和mRNA疫苗虽有效，但多需两剂接种且冷链要求苛刻。2020年12月，Sanchez-Felipe等人在 Nature 发表论文，报道了 YF-S0——一种基于黄热病17D疫苗载体（YF17D）的单剂活病毒载体COVID-19疫苗候选株。通过表达SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike）的非切割前融合形式（S0），该疫苗在仓鼠、小鼠和食蟹猴中诱导了高水平中和抗体和Th1偏向性细胞免疫。在严格的仓鼠攻毒模型中，单剂接种后仅10天即可提供肺部保护，同时展现出比亲本YF17D更优的安全性 profile。

研究流程：

构建YF17D-SARS-CoV-2重组载体（S0/S1/2/S1三种形式）→ BHK-21细胞拯救病毒 → 乳鼠/AG129小鼠/STAT2-/-仓鼠安全性评价 → 仓鼠/小鼠/NHP免疫原性分析（ELISpot检测IFN-γ）→ 单剂/两剂接种 → SARS-CoV-2攻毒保护验证 → 肺部病理学与病毒载量分析

1. 把新冠疫苗从两针等待变成一针速效

传统COVID-19疫苗平台（如mRNA、腺病毒载体、灭活疫苗）大多需要两剂接种才能产生充分保护，且保护性免疫通常需要数周才能建立。这在疫情爆发初期造成了巨大的接种压力和物流挑战。

YF-S0利用黄热病17D疫苗载体——一种已有80年使用历史、单剂即可提供终身保护的活减毒疫苗平台。研究团队将SARS-CoV-2的S0抗原（非切割前融合形式）插入YF17D的E/NS1基因间区，构建了三种候选疫苗（如下图）：

YF-S0：表达全长S蛋白，furin切割位点突变（非切割前融合形式）

YF-S1/2：表达天然可切割的全长S蛋白

YF-S1：仅表达S1亚基

YF-S0在三种候选株中脱颖而出：其S0抗原保留了前融合构象，更易诱导中和抗体；同时furin切割位点突变降低了病毒融合活性，安全性优于亲本YF17D。

2. 从"载体选择"到"免疫验证"

第一步：载体工程与抗原设计

YF17D是一种小型(+)ssRNA活减毒病毒，已获批用于两种人用途重组疫苗（Imojev乙脑疫苗、Dengvaxia登革热疫苗）。研究团队利用反向遗传学系统，将SARS-CoV-2 S抗原作为翻译融合体插入YF17D的E/NS1基因间区。为确保正确的拓扑结构和抗原表达，在S蛋白C端添加了西尼罗河病毒E蛋白的跨膜域作为内质网滞留信号。重组病毒在BHK-21细胞中拯救后，表现出独特的小噬斑表型，提示外源基因插入带来了复制代价。免疫荧光和免疫印迹证实S蛋白正确表达且发生N-糖基化。

第二步：安全性评价——多模型验证

乳鼠颅内接种：YF-S0的神经毒力显著低于YF17D（MDE 17.5天 vs 7天）

AG129小鼠（I/II型干扰素受体缺陷）：10,000 PFU YF-S0仅致1/12动物发病，而1 PFU YF17D即致死

STAT2-/-仓鼠（I/III型干扰素信号缺陷）：YF17D致85%死亡（MDE 7天），YF-S0致>90%存活，且无内脏播散证据

第三步：免疫原性分析——体液+细胞免疫双管齐下

仓鼠两剂接种（103 PFU，第0/7天）后，YF-S0诱导：

100%血清阳转率（12/12）

中和抗体GMT达2.2 Log10（158倍稀释），超过自然感染水平2.5-7.5倍

快速阳转动力学：第14天已有11/12动物阳转

第四步：攻毒保护验证

第21天以2×105TCID50 SARS-CoV-2鼻腔攻毒：

YF-S0组肺部病毒RNA降低5 log10，10/12动物检测不到感染性病毒

肺部病理评分接近正常，细胞因子（IL-6、IFN-γ、IP-10）水平恢复正常

无系统性病毒播散（脾、肝、肾、心）

3. ELISpot揭秘——YF-S0为何偏爱Th1？

SARS-CoV-2疫苗开发中，一个关键担忧是疫苗增强性疾病（VAERD）。2003年SARS-CoV疫苗研究中，Th2偏向性免疫应答可导致嗜酸性粒细胞浸润和急性肺损伤。理想的COVID-19疫苗应诱导Th1偏向性细胞免疫，以IFN-γ和TNF-α为主，避免IL-4/IL-5介导的病理反应。

为精确评估YF-S0诱导的T细胞应答，研究团队选用了JPT Peptide Technologies的两种肽池：

1. PepMix SARS-CoV-2 Spike (货号PM-WCPV-S-2)：覆盖SARS-CoV-2刺突蛋白的158条重叠15肽（15-mers，重叠11个氨基酸），用于检测S特异性T细胞应答

2. PepMix Yellow Fever (NS4B)（货号PM-YF-NS4B）：黄热病毒NS4B蛋白肽库，用于评估载体特异性T细胞应答

用法：将肽库以1.6 ug/mL浓度与脾细胞共孵育18小时，进行ELISpot和胞内细胞因子染色（ICS）。

研究团队使用CTL的Mouse IFN-γ ELISpot Kit（货号mIFNg-1M/5），按以下流程操作Elispot：

包被：抗小鼠IFN-γ捕获抗体包被96孔板

细胞孵育：5×10?脾细胞/孔，加肽库刺激18小时

检测：生物素标记检测抗体 → 链霉亲和素-酶偶联物 → 底物显色

读数：ImmunoSpot S6 Universal Reader自动计数斑点

YF-S0的Th1优势：

1. IgG亚型分析：YF-S0诱导的IgG2b/c显著高于IgG1（Log10比值>1），提示Th1偏向

2. 转录因子谱：TBX21（T-bet，Th1主调控因子）显著上调；GATA3（Th2）适度升高；RORC（Th17）和FOXP3（Treg）无显著变化

3. 流式细胞术验证：CD8+ T细胞以IFN-γ+ 和TNF-α+ 为主；CD4+  T细胞均衡表达Th1/Th2标志物；t-SNE分析显示YF-S0诱导更强的IFN-γ表达密度

YF-S1虽诱导最强的IFN-γ ELISpot应答（甚至超过YF-S0），但完全无法诱导中和抗体，也未提供攻毒保护。这证明：单纯的细胞免疫不足以抵御SARS-CoV-2，中和抗体是保护的必要条件，而ELISpot揭示的Th1偏向性则是安全性的保障。

4. 单剂速效与NHP转化

在疫苗快速部署场景中，单剂接种具有巨大优势。研究团队测试了单剂YF-S0（10? PFU）：

第10天攻毒：5/8动物已受保护，肺部无感染性病毒

第21天攻毒：8/8动物完全保护，病毒RNA降低6 log10

长效免疫：nAb和bAb持续至第12周，提示持久免疫力

食蟹猴（NHP）验证

6只食蟹猴皮下接种105 PFU YF-S0（模拟人用剂量）：

第7天：2/6动物已产生SARS-CoV-2 nAb

第14/21天：6/6动物阳转，GMT达2.5-2.6 Log10

同时诱导保护性YFV nAb（双价保护）

攻毒后咽喉病毒RNA显著降低

YF-S0让COVID-19疫苗接种变得像黄热疫苗一样简单——一针见效，十日成盾，ELISpot揭示的Th1免疫蓝图为其安全性提供了分子级保证。作为ELISpot行业领头羊，CTL创造了几十项ELISPOT/FluoroSpot技术领域的世界第一，也是最早专注ELISpot/FluoroSpot技术开发与自动读板系统的公司。

文献来源：

Sanchez-Felipe L., Vercruysse T., Sharma S., et al. A single-dose live-attenuated YF17D-vectored SARS-CoV-2 vaccine candidate. Nature 586, 578-582 (2020). DOI: 10.1038/s41586-020-3035-9

ELISpot 是一种通过计数分泌特定因子的免疫细胞斑点，来评估免疫功能的检测技术。在疫苗开发中，它通过检测 IFN-γ 斑点数量判断疫苗是否成功诱导 T 细胞免疫；在肿瘤免疫治疗中，通过监测 IFN-γ 或 Granzyme B 分泌细胞评估 PD-1 抗体、CAR-T 等疗法是否激活了抗肿瘤免疫细胞；在传染病领域，ELISpot 试剂盒利用结核特异性抗原刺激检测 IFN-γ，准确鉴别潜伏结核感染与卡介苗假阳性；在自身免疫疾病中，则通过追踪 B 细胞分泌抗 dsDNA 抗体或 IgG 的斑点变化，动态监测 B 细胞清除治疗的疗效。简言之，ELISpot 相当于给免疫细胞做"功能体检"，一个斑点代表一个正在"干活"的细胞，数清楚斑点就能精准判断免疫状态和治疗效果。想了解ELISpot，请咨询CTL中国区代理商——艾美捷科技！