直接免疫荧光染色时，细胞与直接偶联有荧光染料（如 FITC 标记）的抗体孵育。这种方法的优点在于只需要一步抗体孵育，从而排除了二 抗非特异性结合的可能性。这对细胞内染色特别有用，因为包含二抗的大抗体荧光复合物有可能被困住，造成非特异性结合甚或无法进入细胞，而使一抗检测不到。

用于对靶蛋白进行检测/染色的荧光染料被相应激发波长的激光激发时将发出光线。那些被荧光标记了的颗粒或细胞，可以个别检测和分析。

悬浮缓冲液中被染色细胞样品通过流式细胞仪时，由于鞘液的作用，细胞被限制在液流的轴线上，从而能通过一个非常小的喷嘴。这种微小 的“流液束”使细胞一个接一个地通过激光。

ELISA 疑难解答包括：阴性对照出现阳性结果问题以及实验步骤操作路程会遇到的问题。

用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀释抗原到 PVC 微孔板上，按要求往后进行系列稀释。

通常将未知浓度样品与阳性对照标准曲线相比较，可精确定量。每块板都要带标准（做平行或者三份）和空白对照以保证精确性。

用鼠抗体对鼠组织染色是个复杂的过程，因为容易导致背景染色高，而且很难消除。 形成这种背景主要是由于组织染色时二抗与内源性的鼠 IgG，或 B 细胞、浆细胞及巨噬细胞上的 Fc 受体结合造成的。

出于多种考虑，将小组织片段简单浸泡在固定液中便能得到合适的固定，对大多数组织来说可能是唯一的固定模式。然而更快、更均一的固 定方法是将固定液通过管道系统如心主动脉或腹部主动脉灌注到组织中。下面介绍一下用 4% 多聚甲醛固定大鼠大多数器官的操作步骤。

固定就是保持抗原细胞和亚细胞结构固定不动，同时又能使抗体进入到细胞和亚细胞的所有部位。固定和通透方法的选择取决于抗原表位和 抗体本身的灵敏性，有时需要优化。

关于免疫组织化学内容，今天要介绍的是冷冻切片切割技术和免疫细胞化学 (ICC) 指南的具体步骤。

免疫组织化学 (IHC) 是确定组织切片上蛋白的存在与否及存在位置的一种方法。尽管这种方法在定量分析时灵敏度较免疫印迹法或 ELISA 等 免疫测定方法低，但是它能观察到整个组织的情况。适用于评估癌症等疾病的发展及治疗情况。

无信号:一抗和二抗不匹配,二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白