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PE,APC,PE-Cy5,流式抗体荧光该怎么选?

发布者:艾美捷科技    发布时间:2021-08-06     
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流式抗体荧光选择技巧:

 

在进行流式细胞仪多色分析时,如果想得到理想的分析结果,就需要选择好抗体的荧光搭配。常考虑的影响因素有以下几点:

 

1.荧光素的荧光强度

一个特定抗体,能否区分阴性与阳性结果,靠的是抗体上结合的荧光素标记。每一种荧光素的光量子释放能力不同,相对荧光强度不一样,一般用染色指数(staining index)来比较不同荧光标记的光信号强度。染色指数是阳性信号和阴性信号差异与阴性峰分布宽度比值,是判断该荧光染料辨别弱阳性表达的能力。因此,对于特定的单克隆抗体,由于使用了不同的荧光素标记,其阴性细胞核阳性细胞的S/N比值(信噪比)可以相差4-6倍。一般来讲,荧光信号由强到弱的的排序是:PE>APC>PE-Cy5>PERCP-Cy5.5>FITC>PERCP。

 

2.荧光素标记效率:

抗体上标记荧光素的数量(F/P)值也会影响相对荧光强度。每一个抗体上可标记几个FITC或PERCP分子(通常为2-9个),而APC和PE的标记量约为每个抗体标记一个荧光分子。FITC为小分子化合物,而PE,PERCP和APC则是分子量较大的荧光蛋白。受荧光标记物的化学性质要求限制,IGM型抗体通常只用小分子的荧光素进行标记,如FITC、TEXAS RED、Cy3和Cy5。

 

3.抗原表达丰度

高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测,而较低表达的抗原则需要用较高亮度的荧光素标记的抗体进行检测,从而达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的。

 

4.细胞自发荧光:

每个细胞群体都带有不同水平的自发荧光,由于细胞的自发荧光在高波长范围里(>600nm)迅速降低,所以在检测自发荧光水平高的细胞时,使用发射波长较长的荧光染料(比如APC)可以得到较好的检测结果。

 

5.非特异性结合

有些荧光标记的抗体会表现出低水平的非特异性结合,就会造成阴性细胞的荧光水平升高。

 

常见流式抗体荧光染料简介:

 

常见流式抗体荧光染料简介.jpg

 

1) 藻红蛋白(phycoerythrin,PE):PE是从红藻中分离纯化获得的一种常见染料,经激光激发后发出橙黄色荧光,最大发射波长为575 nm。PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点,可用于标记表达水平较低的蛋白。在流式细胞术检测中,PE标记的抗体适用于所有配备488 nm氩离子激光器的流式细胞仪。

 

2) PE-Cy5:PE-Cy5是一种复合染料,属于藻红蛋白偶联物,在此类复合染料中,激发能量可从PE传递到Cy5上,最大发射波长为667 nm。由于PE-Cy5与FITC、PE在光谱上重叠范围较少,荧光干扰少,因此实验中常将PE-Cy5与FITC、PE搭配使用。需注意,PE-Cy5不适合与APC搭配使用,两者荧光重叠大。

 

3)PE-Cy5.5:PE-Cy5.5也是一种复合染料,能量从PE传递到Cy5.5上,最大发射波长为694 nm。同PE-Cy5不一样,PE-Cy5.5与FITC、PE、APC间荧光干扰小,可搭配使用,且其荧光强度要优于PE-Cy5。

 

4) PE-Cy7:复合染料,最大发射波长为785 nm。PE-Cy7与FITC无光谱重叠,与APC重叠也较少,因此其可与FITC、PE、APC搭配使用。在实验中需要注意,PE-Cy7的光淬灭性很强,需要绝对避光环境。

 

5) PerCP-Cy5.5:复合染料,最大发射波长为695 nm。PerCP-Cy5.5光量子产率高,可用于表达水平较低物质的检测,与PerCP-Cy5.5相反,PerCP的光量子产率较低,适用于表达水平较高物质的检测,在双激光管仪器上与APC共同检测时,需要做补偿调节,但比PerCP补偿少。

 

6) PI/7-AAD:碘化丙啶(propidium iodide,PI)和7-AAD(7-amino-actinomycin D)的最大发射波长分别为617 nm和647 nm,是常见的荧光染料,常用于细胞凋亡检测,可用于鉴别死、活细胞。在大部分流式细胞仪上,PI在FL2或FL3通道检测,7-AAD在FL3通道检测。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性,但其发射波谱较PI窄,对其他检测通道的干扰更小,在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。


7) 别藻青蛋白(allophycocyanin,APC):APC最大发射波长为660 nm,其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪,检测通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC搭配是经典3色搭配。

 

8) Cy5:Cy5属于小分子染料,其最大发射波长为670 nm,其标记的抗体适用于所有配备633 nm氩离子激光器的流式细胞仪,检测通道一般是FL4通道。除流式细胞术外,Cy5同样适用于传统的荧光显微镜技术。需注意的是,Cy5与单核细胞和粒细胞的非特异性结合多,实验结果容易出现假阳性。

 

9) 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC):FITC是应用最为广泛的一种荧光素,经激光激发后发出明亮的黄绿色荧光,最大发射波长为525 nm。FITC的荧光强度受PH影响较大,常随着PH的降低而减弱,因此,在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。

 

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产品名称货号规格
PE [R-Phycoerythrin]255610mg
PE-Cy5 Tandem26101mg
PE-Cy5.5 Tandem26131mg
PE-Cy7 Tandem26161mg
PE-Cy5.5 Tandem蛋白/抗体标记试剂盒1316/13412 Labelings
APC [Allophycocyanin]25541mg
APC-Cy5.5 Tandem26221mg
APC-Cy7 Tandem26251mg
PerCP-Cy5.5 Tandem26501mg
APC-Cy5.5 Tandem 蛋白/抗体标记试剂盒13202 Lalelings

 

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