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【文献解读】BPS Bioscience,PARPtrap 试剂盒,助力新型强效PARP抑制剂的研发

发布者:艾美捷科技    发布时间:2023-12-25     
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PARP是一种在DNA修复、转录、凋亡和免疫功能中发挥关键作用的酶。PARP-1招募合成DNA酶来激活DNA修复。PARP-2维持基因组稳定性并修复DNA单链断裂(SSB。PARP-1和PARP-2在DNA修复系统中具有相同的调节机制,但它们与DNA断裂结合的机制不同。PARP抑制剂与PARP酶结合后,PARP蛋白会与DNA损伤位点结合形成PARP-DNA复合物而无法分离,这就造成了其他DNA修复蛋白无法参与修复过程,甚至会造成进一步形成DNA的双链损伤,这就是制剂所造成的PARP Trap效应。由于PARP Trap对肿瘤细胞的具有更强的杀伤效应,因此,对抑制剂的PARP Trap能力检测变的非常重要。  

PARP Trap.png


迄今为止,四种PARP抑制剂(olaparib、rucaparib、niraparib和talazoparib)已获得FDA批准用于各种适应症,如卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌患者。PARP抑制剂对PARP家族成员和PARP-DNA捕获效力表现出不同的抑制作用。这些特性与独特的安全性/有效性特征相关。 

近期,国际团队在Molecular Cancer Therapeutics(AACR)在线发表了题为"Venadaparib Is a Novel and Selective PARP Inhibitor with Improved Physicochemical Properties, Efficacy, and Safety"的文章,合成了新型强效PARP抑制剂维那达帕利(Venadaparib,也称为IDX-1197或NOV140101),评估了Venadaparib对PARP酶、PAR形成和PARP捕获活性的疗效,以及对BRCA突变细胞株的生长抑制作用,还建立了体外和体内模型,以研究药代动力学/药效学、疗效和毒性。Venadaparib将有望成为下一代PARP抑制剂。Venadaparib的疗效和安全性的Ib/IIa期研究已经启动。  


艾美捷科技作为BPS Bioscience中国区代理,非常荣幸能够作为供应商为该项研究提供高品质PARPtrap Assay Kit for PARP1(80584),为生物医学领域的科研探索贡献一份力量。  


PARPtrap Assay Kit for PARP1-1.png


BPS Bioscience特别的PARPtrap检测试剂盒,非常适用于药物研发和高通量筛选应用中,筛选增强PARP/DNA固定能力的小分子化合物。

货号名称规格说明
80584-1PARPtrap Assay Kit for PARP196rxns.筛选增强PARP1/DNA固定能力的小分子化合物,并用于确定化合物的IC50值。
80584-2384rxns.
78296-1PARPtrap Assay Kit for PARP296rxns.筛选增强PARP2/DNA固定能力的小分子化合物,并用于确定化合物的IC50值。
78296-2384rxns.
78317PARPtrap Combo Assay Kit for PARP1 and PARP2384rxns筛选增强PARP1/2在DNA上的固定能力的小分子化合物,并用于确定化合物的IC50值。

* 以上产品,均为荧光偏振测定法(fluorescence polarization, FP)


引用产品:

该项研究中使用了艾美捷科技代理的BPS Bioscience的PARPtrap Assay Kit for PARP1(80584),用于检测PARP1捕获检测。  


【实验技术,延伸解读】

① PARP trapping assay,PARP捕获检测试验

Venadaparib对重组人PARP-1酶的DNA结合活性的影响是通过BPS Bioscience进行的体外酶活性测定来确定的。PARPtrap酶活性测定试剂盒(目录号80584;BPS Bioscience)用于该测定。Venadaparib、olaparib、rucaparib、niraparib、talazoparib和veliparib在浓度范围为0.000026至5μmol/L进行了检测。根据制造商的说明进行酶反应后,使用激发波长为485nm和发射波长为528nm的M1000微孔板阅读器(Tecan Infinite)测量了荧光信号。 


② Enzymatic assay against recombinant PARP enzymes,重组PARP酶的酶学检测

venadaparib对重组人PARP酶(PARP-1、PARP-2、PARP-3、TNKS-1、TNKS-2、PARP-6、PARP-7、PARP-8、PARP-10、PARP-11、PARP-12、PARP-14和PARP-15,均采购自BPS Bioscience)进行了体外酶活性分析。Venadaparib在浓度范围为0.000005至10μmol/L进行检测。采用Synergy 2微孔板读数仪(BioTek Instruments)测量了发光输出。使用Prism 9(GraphPad Software)确定了IC50。 


【产品解读】

PARPtrap Assay Kit for PARP1(80584)

PARPtrap Assay Kit for PARP1旨在利用荧光偏振(FP)高通量筛选测定法测量PARP1/DNA复合物形成。PARP1以其DNA结合结构域而闻名。与DNA的结合激活PARP1,在NAD+存在的情况下,PARP1会对自身进行核糖基化(自动核糖基化),这导致核糖聚合物的负电荷积累,从而导致PARP1从DNA上解离。然而,在一些抑制剂的存在下,PARP仍然与DNA结合,这种现象称为困扰。已经证明,被困的PARP-DNA复合物对癌细胞具有高度毒性,因此这类抑制剂对癌症治疗可能是可取的。  

PARPtrap Assay Kit for PARP1-2.png

PARPtrap Assay Kit for PARP1的关键是荧光标记的寡核苷酸双链。在未发生核糖基化的情况下,PARP1与荧光探针结合,形成大的复合物,并导致高度偏振光的发射。然而,在自动核糖基化后,PARP1从寡核苷酸双链解离,然后自由旋转,发射较少偏振光。添加PARP1抑制剂会导致PARP1被困在荧光寡核苷酸双链中,并以剂量依赖的方式增加FP信号。 

PARPtrap Assay Kit for PARP1是一种荧光偏振均相分析法。FP信号是使用能够测量荧光偏振的荧光微孔板读数器来测量的。   


产品组分:(96次规格,为例)

货号名称规格保存条件
80501PARP1, GST-tag*1 ug-80°C
78273Fluorescent labeled oligonucleotide duplex (25 nM)100 ul-80°C

5x PARPtrap assay buffer2 x 1 ml-80°C

10x NAD+500 ul-80°C
79685Black 96-well plate1Room Temp


实验步骤(简易汉化,请务必以英文原版说明书为准):

  • 所有样本和对照应进行重复操作。

  • 实验应包括一个“空白”、一个“参考”,一个“低FP对照”和一个“高FP对照”。

  1. 准备Master Mix(每孔20 ul):N孔 x(6 μl 5倍PARPtrap测定缓冲液 + 1 ul 25 nM荧光标记的DNA + 13 μl蒸馏水)。例如,对于20个孔,准备:120 μl 5倍PARPtrap测定缓冲液 + 20 ul 25 nM荧光标记的DNA + 260 μl蒸馏水。

  2. 通过将1份5倍PARPtrapTM测定缓冲液稀释为4份蒸馏水,制备1倍PARPtrapTM测定缓冲液。只稀释所需的试剂量。

  3. 准备抑制剂溶液。

    如果抑制剂化合物溶解在DMSO中,将其在水中稀释10倍,使得所有样本中DMSO的最终浓度为1%。如果化合物溶解在除DMSO以外的稀释剂中,请使用该稀释剂制备对照稀释剂溶液。

  4. 准备酶: 在冰上解冻PARP1酶。简短离心含有酶的管子,使其完全恢复管子中的全部内容。用1倍PARPtrap测定缓冲液稀释酶至约0.5 ng/ul。

    注意:PARP1酶对冻结/解冻很敏感。避免多次冻结/解冻。虽然我们不建议这样做,但如果不一次使用所有试剂孔,请计算所需的PARP1量,只稀释足够实验所需的量,并将剩余的未稀释PARP1酶分装并储存在-80°C。不要再次使用解冻的分装液或稀释的酶。

  5. 按照下表向“高FP对照”,“低FP对照”,“测试抑制剂”和“参考”孔中加入反应的每个组分:

  6. 向标记为“空白”的孔中加入12 ul 5倍PARPtrap测定缓冲液 + 28 ul蒸馏水 + 5 ul稀释剂(例如DMSO 10%)。

    注意,“空白”包含反应的缓冲成分,但不包含荧光探针或PARP1酶。

    备注:

  • 参考:一个缺乏PARP1的阴性对照,其中所有荧光DNA以自由形式存在,FP最低(与空白不同,空白中没有荧光探针)。参考用于进行计算。

  • 高FP对照:不添加NAD+的条件,因此所有与荧光DNA结合的PARP1不能发生核糖基化反应,仍与DNA结合,导致FP达到试剂盒允许的最大值。

  • 低FP对照:在存在NAD+的情况下,所有与荧光DNA结合的PARP1都被允许发生核糖基化反应并与DNA解离,导致主要为自由DNA和低FP。这是在没有抑制剂的情况下对应于最大PARP1核糖基化活性的条件。

  • 测试抑制剂:FP将与抑制活性水平和结果陷阱在荧光核苷酸双链上成正比增加。

  • 稀释剂溶液:与用于制备测试抑制剂的DMSO浓度相同,但不含抑制剂。

  1. 室温孵育30-60分钟。

  2. 向标记为“高FP对照”的孔中加入5 ul蒸馏水。

  3. 向“空白”、“低FP对照”、“测试抑制剂”和“参考”孔中加入5 ul 10倍NAD+,启动PARP1酶反应。不要向“高FP对照”中加入NAD+。 这将使最终反应体积达到50 ?l。 室温孵育板子60分钟。

  4. 使用能够在470-480 nm波长范围内激发和在508-528 nm范围内检测发射光的微孔板读数器读取样品的荧光极化值。

    从所有值中减去空白值。


References

  1. Murai, J., et al. Molecular Cancer Therapeutics 2014. 13:433-443.

  2. Murai, J., et. al. Cancer Research 2012. 72:5588-5599.

  3. Zandarashvili, L., et al. Science 2020. 368(6486): eaax6367.


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PARP Enzyme.png

BPS Bioscience,激酶研究专家,活性酶、激酶活性/抑制剂筛选检测试剂盒、慢病毒等,产品涉及临床前药物开发过程的每个阶段,包括磷酸酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白甲基化转移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶(PARP)等热门指标的蛋白酶及酶活/抑制剂筛选检测试剂盒。详情清咨询艾美捷科技:https://www.amyjet.com/ 


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