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【Rockland畅销品】Nature和PNAS都在用的封闭液

发布者:艾美捷科技    发布时间:2022-08-12     
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封闭的原理:

固相载体表面(如Elisa板,NC膜或者PVDF膜上等)有很多孔洞,通过电转或包被,胶上的蛋白被转移到了膜上,或抗原/抗体固定在了板上,蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多孔洞里面,但蛋白覆盖并不是连续的,有很多空隙,而且样品孔之间也有空隙,这些孔洞并没有填进东西,而抗体也是蛋白,也会被吸附在空的洞里,这样就会有很多非特异性的信号。   封闭液中的蛋白可以与固相载体表面上的空白空洞位置结合,同样以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上,因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合,所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上,而只会跟特异性蛋白结合。


封闭剂的种类及选择依据:

封闭剂应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白、不结合靶蛋白表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。常见的封闭剂主要有以下几种:  


1、BSA

BSA是最常用的封闭剂,成分单一适用于大多数情况。若免疫原是偶联BSA的, BSA有很强的免疫原性,会导致产生很多的针对BSA的抗体,为避免交叉反应,不能用BSA、脱脂奶粉等封闭,可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭剂封闭。 大部分BSA中有少量的抗体残留,会导致抗原/抗体之间的交叉反应,产生高背景,杂带较多或使得本底水平增高。  

2、正常血清

封闭血清的原理主要有两点,第一是待检样本会有些与蛋白非特异性结合的物质,从而导致背景过高,因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合,从这点看,BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体,可以和抗体恒定区结合,与抗体特异性无关,封闭血清中有抗体,因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。 免疫组化中用血清封闭的较多。封闭血清一般选择和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合,否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合, 会造成背景。但要注意封闭用血清中不能含有目标蛋白,且与一抗来源不同。另外二抗因尽量少选取兔子或小鼠来源的,因为这两个在亲缘关系上和人类非常接近,所以产生交叉反应的机会就比较大,从而导致背景比较高。适合选用来源于驴,山羊,绵羊等的二抗,背景相对就很低。  

3、脱脂奶粉

脱脂奶粉最大的优点是价格便宜,但是由于成分相对复杂,所以适用范围要狭窄一些。磷酸化抗体也许会导致背景增加,此外,因为自身含有生物素,不能用于生物素标记的抗体系统。 奶粉蛋白种类比BSA多,而WB膜也好,ELISA板也好,表面的微结构都不是那么均匀的,相对而言,不同分子量蛋白种类多的奶粉(BSA只是一种蛋白),封闭起来更全面。 脱脂奶粉中含有少量的生物素和碱性磷酸酶残留,在使用生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时,也会使得高背景或本底水平增高。 由于奶粉的成份复杂,而且封闭后的载体不易长期保存,因此在试剂盒的制备中较少应用。  

4、酪蛋白

和BSA作用类似,普通酪蛋白不易溶解。中性和碱性条件下带有负电性,与同样带负电荷胶体金之间存在排斥力,而膜一般都是带正电荷,会与酪蛋白有一定的吸附作用,用酪蛋白封闭效果好些。    


常规的封闭剂各有优劣,没有任何一种封闭剂能适合所有的实验,今天给大家带来一款知名免疫试剂供应商Rockland生产的,总体效果显著优于传统的像BSA(牛血清白蛋白)、脱脂奶粉、酪蛋白(Casein)等的封闭剂,他在荧光WB和蛋白芯片微阵列应用中表现不俗,同时也可以用于Elisa,IHC/IF等应用~ 


荧光WB封闭剂推荐:


荧光WB封闭剂


货号名称规格应用类型
MB-070Blocking Buffer for Fluorescent Western Blotting 荧光WB封闭缓冲液500mlWB,ELISA,IF,IHC,IP,Microarray(微阵列)


MB-070用于PEPperCHIP? 肽微阵列的封闭,显示出显著优于其他常规封闭剂的性能:


不同封闭剂在使用 PEPperCHIP? 肽微阵列进行表位定位时的性能比较

不同封闭剂在使用 PEPperCHIP? 肽微阵列进行表位定位时的性能比较:用 2% 脱脂奶粉 (A)、1% HSA (B)、1% BSA (C) 或 100% Rockland 封闭缓冲液 (D) 封闭 PEPperCHIP?肽微阵列30分钟。以1:200的稀释度测定人血清样品,然后用山羊抗人 IgG (H+L) DyLight 680 二抗和对照抗 HA (12CA5)-DyLight 800 抗体进行检测。


其他封闭剂推荐:


货号名称图片/应用背景
MB-064-0100ELISA Microwell Blocking Buffer with Stabilizer(适用于包被完抗原/抗体后的Elisa 96孔板的封闭及稳定保存)

适用于包被完抗原/抗体后的Elisa 96孔板的封闭及稳定保存

BSA-50Bovine Serum Albumin - Fraction V(BSA)

BSA

B304Normal Goat Serum(正常山羊血清)

正常山羊血清

MB-067-0100

MB-066-0100 

MB-065-0100

TBS Fish Gel Concentrate 10X PBS Fish Gel Concentrate 10X BBS Fish Gel 10X (鱼胶)用鱼胶当封闭液是从猪皮胶演变而来的。鱼胶是从冷水鱼的皮肤中提取出来的,即使在温度较低的情况下也会不会凝固。通常使用的浓度为0.1-5% (w/v)。不像脱脂奶粉和BSA,它不含有任何的血清蛋白,所以就不会和哺乳动物抗体产生交叉反应,大大降低了背景信号。但是鱼胶不能用来封闭生物素-抗生物素抗体蛋白系统,因为它含有内源性生物素。
K505Blocking Buffer Sampler Kit(是包含正常山羊血清,BSA,MB-070,MB-064-0100和MB-067-0100的套装)

正常山羊血清

MB-070-010TFBlocking Buffer For Immunohistochemistry Serum And Azide Free(IHC专用封闭剂)

IHC专用封闭剂


以上产品仅用于科研,不能用于医疗诊断~  


MB-070的引文(截至目前收录的引文共138篇,篇幅有限仅展示5篇):

Rieger AC et al. Growth hormone-releasing hormone agonists ameliorate chronic kidney disease-induced heart failure with preserved ejection fraction. Proc Natl Acad Sci USA. (2021) 

van der Weegen Y, Golan-Berman H, Mevissen TET, et al. The cooperative action of CSB, CSA, and UVSSA target TFIIH to DNA damage-stalled RNA polymerase II. Nat Commun. (2020) 

Werner CT et al. Neuroadaptations in the dorsal hippocampus underlie cocaine seeking during prolonged abstinence. Proc Natl Acad Sci USA (2020) 

Spence et al. In vivo proximity proteomics of nascent synapses reveals a novel regulator of cytoskeleton-mediated synaptic maturation. Nature Communications (2019) 

Lombardi AA, Gibb AA, Arif E, et al. Mitochondrial calcium exchange links metabolism with the epigenome to control cellular differentiation. Nat Commun. (2019)   


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