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鸟苷酸交换因子(GEF)活性检测工具,实验省心又省力

发布者:艾美捷科技    发布时间:2021-07-21     
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小G蛋白的共同特点是,当结合了GTP时即成为活化形式,这时可作用于下游分子使之活化,而当GTP水解成为GDP时(自身为GTP酶)则恢复到非活化状态(分子开关),正常情况下,在细胞中,小G蛋白会在跟GDP结合的“关闭状态”和 GTP 结合的“开启状态”之间循环,这种循环过程主要由细胞内的小G蛋白调节因子来控制,胞内小G蛋白调节因子主要有两类:一类是可以增强小G蛋白的活性的鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor, GEF),另一类是可以降低小G蛋白活性的GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein, GAP)。

 

GTP酶活化蛋白.jpg

 

今天我们就主要来聊一聊小G蛋白活性增强剂——鸟苷酸交换因子(GEF),GEF 是通过催化其目标 GTPase上的核苷酸交换来发挥作用,GEF与核苷酸结合的 GTPase 结合,这会导致结合的核苷酸被释放,从而产生不含核苷酸的GEF-GTPase 反应中间体。这种不含核苷酸的复合物随后将结合新的核苷酸,然后GEF再从GTPase 中释放出来。

 

由于GEFs对GDP-GTPases的亲和力高于对相应GTP-GTPases的亲和力,在正常细胞中GTP和GDP比率约为10:1,GEFs将推动从GDP-GTPases到GTP-GTPases的转换。

 

在这里小艾给大家带来一款独一无二的GEF活性检测试剂盒,这是一款基于荧光法的检测GTP酶上的核苷酸转换的试剂盒,可适用于常规的96孔格式或高通量384孔格式。

 

该试剂盒包含检测所需的所有试剂:

1.Exchange Buffer

2.His标签 Cdc42蛋白

3.His标签 Rac1 蛋白

4.His标签 RhoA 蛋白

5.His标签 hDbs 蛋白(作为 Cdc42 和 RhoA 的GEF的阳性对照 )

6.黑色384孔板

7.黑色96孔板

 

检测原理:该试剂盒是通过检测荧光核苷酸类似物 N-甲基邻氨基苯甲酰-GTP(mant-GTP)对 GTPase 的结合情况来检测GEF的活性的。一旦mant-GTP与 GTPase 结合, mant-GTP的荧光强度(Ex:360 nm,Em:440 nm)显著增加,通过检测游离的mant-GTP和GTPase 结合的 mant-GTP 之间的荧光值差异,即可检测样本中GEF的活性。

 

本试剂盒的主要用途和应用:

  1. 测定未知GEFs活性;

  2. 小GTPases及其相关GEFs的生化特性表征;

  3. 研究不同辅助因子或蛋白结构域对GEF活性的调控;

  4. 筛选GEFs或GTPases突变蛋白的活性和底物特异性;

  5. HTS(高通量筛选)筛选鉴定GEF抑制剂。


检测结果展示:

96 孔板中Dbs 对于Cdc42、RhoA 和 Rac1 的交换活性.jpg

图 1.  96 孔板中Dbs 对于Cdc42、RhoA 和 Rac1 的交换活性

384 孔板中Dbs 对于Cdc42、RhoA 和 Rac1 的交换活性.jpg

图 2.384 孔板中Dbs 对于Cdc42、RhoA 和 Rac1 的交换活性

 

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货号名称规格
BK100RhoGEF Exchange Assay60-300assays


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货号产品名称Ras类型规格
CD01Cdc42 protein (His-tagged)Rho1 x 100 ug
RH01RhoA protein (His-tagged)Rho1 x 100 ug
RC01Rac1 protein (His-tagged)Rho1 x 100 ug
RS01H-Ras protein (His-tagged)Ras1 x 100 ug
RS03K-Ras protein (His-tagged)Ras1 x 100 ug
RS04-RS14K-Ras mutants G12C, G12D, G12V,
G12D+I36N, G12D+D38A, G13D, G13S,
Q61P, K128A, and R135A proteins (His- tagged).
Ras1 x 100 ug
RC03RhoC protein (His-tagged)Rho1 x 100 ug
CS-GE01-AHuman Dbs protein (His-tagged)Rho GEF family1 x 50 ug
CS-GE02SOS1 GEF protein (Exd exchange domain,
aa564-1049, His-tagged)
Ras1 x 100 ug
CS-GE03RasGRF1 GEF protein (Cdc25 exchange
domain, aa 1038-1270, MBP-tagged)
Ras1 x 100 ug
CS-GE04Tiam1 GEF protein (DHPH exchange do-
main, aa 1040-1406 MBP-tagged)
Rho1 x 100 ug
CS-GE05VAV1 GEF protein (DHPHC1 exchange domain,
Y174D mutant, aa 168-522, His- tagged)
Rho1 x 100 ug
CS-GE06VAV2 GEF protein (DH exchange domain, aa 189-
374, His-tagged)
Rho1 x 100 ug
CS-GE07ARNO GEF protein (Sec7 exchange do-
main, aa 31-267, His-tagged)
Arf1 x 100 ug
CS-GE08SOS12 GEF protein (Exd exchange domain, aa563-
1051, His-tagged)
Ras1 x 100 ug
BK008Ras activation assay biochem kitRas25 assays
BK034Cdc42 activation assay biochem kitRho25 assays
BK035Rac1 activation assay biochem kitRho25 assays
BK036Rho activation assay biochem kitRho25 assays


用BK100发表的部分引文赏析:

 

1.Eshraghi, M. et al. RasGRP1 is a causal factor in the development of l-DOPA-induced dyskinesia in Parkinson’s disease. Sci. Adv. 6, eaaz7001 (2020).

2.Miao, H., Vanderleest, T. E., Jewett, C. E., Loerke, D. & Todd Blankenship, J. Cell ratcheting through the Sbf RabGEF directs force balancing and stepped apical constriction. J. Cell Biol. 218, 3845–3860 (2019).

3.Singh, N. K., Janjanam, J. & Rao, G. N. P115 RhoGEF activates the Rac1 GTPase signaling cascade in MCP1 chemokine-induced vascular smooth muscle cell migration and proliferation. J. Biol. Chem. 292, 14080–14091 (2017).

4.Rosenberg, B. J. et al. Phosphorylated cortactin recruits Vav2 guanine nucleotide exchange factor to activate Rac3 and promote invadopodial function in invasive breast cancer cells. Mol. Biol. Cell 28, 1347–1360 (2017).

5.Moey et al., 2011. Ginseng (Panax quinquefolius) attenuates leptin-induced cardiac hypertrophy through inhibition of p115RhoGEF-RhoA/ROCKdependent MAPK pathway activation.  Pharmacol. Exp. Ther. doi:10.1124/jpet.111.182600.

6.Oliver et al., 2011. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42.  J. Cancer. 104, 324-331.

7.Guilluy et al., 2010. The Rho exchange factor Arhgef1 mediates the effects of angiotensin II on vascular tone and blood pressure.  Med. 16, 183-190.

8.Arbeloa et al., 2010. EspM2 is a RhoA guanine nucleotide exchange factor.  Microbiol. 12, 654-664.

9。Kim et al., 2009. Dipeptidyl Peptidase IV Inhibition With MK0431 Improves Islet Graft Survival in Diabetic NOD Mice Partially via T-Cell Modulation. Diabetes. 58, 641-651.

10.Li et al., 2009. PLC-gamma1 and Rac1 Coregulate EGF-Induced Cytoskeleton Remodeling and Cell Migration.  Endocrinol. 23, 901-913.

 

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