大盘点：彗星实验(单细胞凝胶电泳)疑难杂症

【前情回顾】彗星分析怎么做？专业彗星分析试剂盒一站式解决方案

【前情回顾】Comet Assay Kits 彗星分析试剂盒说明书（以STA-350，3孔板为例）

我们都知道彗星实验（comet assay）的别名也叫单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis，SCGE）,是用来有效评估DNA损伤的一种检测方法，或许它的检测原理你已经熟记于心了，但是它究竟有哪些应用，实验过程中常见问题有哪些，不同问题又要怎么处理。。。。。。看到这里是不是有些凌乱了，今天我们就来一锅烩了它！

原理：器官或组织经处理（化学或物理因素，如辐射、重金属等）后，细胞中的DNA发生单链或双链断裂，经细胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在电场作用下，DNA 断片迁移出细胞核，形成彗星状的电泳图谱。正常细胞的大分子DNA在电场作用下迁移距离较短，DNA仍保留在细胞核的范围，形成圆形或轻微拖尾的图谱。DNA损伤愈大，DNA碎段就愈多，愈小的DNA碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。DNA碎段的游动的程度不同，使它呈现出彗星状，彗星的长度（从细胞核到彗星尾端的距离）与DNA的损害程度有关，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。

应用：DNA损伤是指由化学或物理因素引起的DNA链断裂、分子基体修饰和DNA交联等。如果这种损伤没有得到及时修复，就会引起突变，乃至癌变。彗星实验从一种在单细胞水平上检验DNA链损伤的灵敏方法，可以用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体DNA修补的影响程度。目前彗星实验已经逐步成为筛选致癌和致突变遗传毒性物质、监测环境介质中的遗传毒性物质和研究化合物致癌作用机理的重要方法，在风险评价，尤其是在土壤和水环境污染潜在生态风险和致癌健康风险的研究方面也取得了很多重要的研究成果。由于DNA损伤关系到生物个体遗传信息的表达，与种群密度和生态群落影响很可能存在直接或和间接联系，因此该效应标记方法将不仅仅是从生物个体角度起到环境预警的作用，从区域管理的角度也可能作为反映生态和健康效应的重要指标。另外，鉴于彗星实验对于真核细胞的普遍适用性，也为目前致癌物环境毒理组学研究和致癌风险评价体系提供了重要的手段。

传统的彗星分析方法步骤繁琐，需要单独配置裂解试剂，需要提前对样品DNA进行处理，且每次检测样品有限，染色过程中需要EB等致癌染料。Cell Biolabs的OxiSelect? Comet Assays (Single Cell Gel Electrophoresis)克服了上述障碍，可以一次进行多个样品的处理，解决了由于处理时间不同而导致的实验结果差异。而且OxiSelect? Comet Assays (Single Cell Gel Electrophoresis)试剂盒可提供多种样式供您选择，有3孔板（货号：STA-350/351/351-5）和96孔板不同样式。其中OxiSelect? Comet Assay Kit中，包含彗星分析载玻片、彗星分析用琼脂糖以及其它试剂；另外Cell Biolabs根据您的实验要求，还单独提供彗星分析载玻片，也根据3孔板样式和96孔板样式分为多种样式。

彗星实验试剂盒信息：

彗星实验试剂盒内特殊处理电泳载玻片：

除了操作简便，OxiSelect^TMComet Assay Kit还有以下优点：

1）适用于各种DNA损伤检测，是一款非常好用的DNA损伤检测筛选工具；

2）试剂盒中的载玻片经过特殊处理以粘附低熔点琼脂糖，避免“脱胶”问题出现；

3）采用特殊的DNA荧光染料，能有效降低背景干扰，更加方便读取实验结果。

常见问题：

Q1: 彗星分析试剂盒可以检测什么类型的损伤？

A1: 彗星分析试剂盒检测结果提供了DNA损伤的全局图，可以检测DNA双链断裂，单链断裂和AP位点引起的损伤变化。根据电泳缓冲液的pH值不同，可分为中性彗星实验（pH=8.4）和碱性彗星实验（pH＞13）。中性彗星实验主要用于检测DNA单链、双链以及一部分AP位点的断裂损伤，碱性彗星实验具有更高的灵敏性，可用于检测更少量的单链和双链断裂损伤,以及大部分AP位点和碱不稳定的DNA加合物。

Q2: 彗星玻片可以重复使用吗?(这个是最近问得最多的一个问题)

A2：不能。Comet载玻片表面经过了特殊处理，一旦整个载玻片经历了变性，电泳和洗涤的操作步骤，就不能再重复使用了。

Q3：我可以用常规载玻片代替Comet载玻片吗？

A3：不能，Comet载玻片已经过化学预处理，以增加附着力。 如果采用常规载玻片的话，您的细胞/琼脂糖液滴将无法停留在载玻片上。

Q4：阳性对照怎么设置？

A4：用20uM依托泊苷(etoposide)处理细胞4小时，以形成彗星尾巴作为阳性对照。

Q5：用Vista Green染料染色后的玻片可以保存多久？

A5： 用Vista Green染色后的玻片可在4?C的黑暗环境中保存3个月，荧光也不褪色。 干燥且未沾有Vista Green的载玻片可以保存一年。

Q6：哪种电泳仪适合该彗星分析试剂盒？

A6：彗星分析试剂盒可用于任何水平电泳槽，不限于任何特定型号，但不能与垂直电泳仪一起使用。

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