胶原蛋白代谢的失调可能导致如纤维化(胶原蛋白过多)或骨关节炎(胶原蛋白过少)等病理状态。因此,在许多与疾病相关的研究中,测量胶原蛋白的生成是重要的。
羟脯氨酸是一种非蛋白质氨基酸,在哺乳动物中出现在弹性蛋白和胶原蛋白中。它的存在主要限于胶原蛋白的三螺旋结构中,在那里它增加了三螺旋结构的稳定性。羟脯氨酸是在翻译后由酶脯氨酸羟化酶作用于特定的脯氨酸残基而形成的。组织水解产物中的羟脯氨酸可以用作胶原蛋白含量的直接测量。
QuickZyme敏感组织羟脯氨酸检测试剂是对Prockop和Udenfriend(《分析生物化学》,1960年,1: 228-239)描述方法的改进。该检测测量样本中存在的总羟脯氨酸量。如果这些羟脯氨酸是通过胶原蛋白的水解获得的,它代表了样本中存在的所有类型的胶原蛋白,而不会区分胶原蛋白的类型以及前胶原蛋白、成熟胶原蛋白和胶原蛋白降解产物。
该检测简单,产生的色素在570纳米处有z大的吸收。该检测被开发用于测量酸性组织和/或蛋白质水解产物中的羟脯氨酸,其方式是不需要酸解胶原蛋白后的干燥步骤,而这通常需要特殊设备。
现在羟脯氨酸可以很容易地在胶原蛋白水平低的小组织样本中测定。
艾美捷QuickZyme 灵敏组织羟脯氨酸测定法用于羟脯氨酸的定量测定。QuickZyme敏感组织羟脯氨酸检测试剂盒是唯1一种基于羟脯氨酸的检测试剂盒,它没有基质效应,也不需要进一步稀释水解产物,可以在低羟脯氨酸浓度的小样本中进行测量。此外,不需要干燥水解产物,从而实现了快速(<2小时)、灵敏和简单(96孔板型)的测定。
数据分析:
有几种选项可用于计算检测样本中羟脯氨酸浓度。建议使用一个软件包来处理数据,该软件包采用回归曲线拟合程序。如果没有可用的软件包,可以按照以下方法手动计算羟脯氨酸浓度。
1、计算每个标准品或样本的重复读数的平均值,并从所有读数中减去空白的平均值。
2、通过在y轴上绘制每个标准品的平均A570(减去空白)与x轴上的羟脯氨酸含量(0-12.5-25-50-100-150-200-300微摩尔羟脯氨酸)相对应,创建一个标准曲线。在图表上的点之间画出z佳拟合的线性化曲线。使用这个标准曲线将测试样本的A570值转换为微摩尔羟脯氨酸。这样就可以得到水解产物中的羟脯氨酸浓度。如果在水解后包括了稀释步骤,则应将浓度乘以稀释因子,以得到水解产物中的羟脯氨酸浓度。根据样本的准备情况,可以计算出原始样本中羟脯氨酸的含量。
典型的羟脯氨酸标准曲线:
所示的数据曲线(见下方)仅供参考。确切的A570值可能会根据每个实验略有不同。
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