蛋氨酸含量高效测定工具--蛋氨酸检测试剂盒

蛋氨酸是一种动物必需的氨基酸，因此必须通过饮食来源获取。在鸡蛋、肉类、鱼类以及芝麻、巴西果仁和其他一些植物种子中可以检测到高含量的蛋氨酸。大多数水果和蔬菜中蛋氨酸含量较低。除了在蛋白质结构和功能中的传统作用外，蛋氨酸还作为合成其他氨基酸（如半胱氨酸和牛磺酸）以及重要的抗氧化剂谷胱甘肽的途径中的底物。蛋氨酸对人类和许多其他物种的代谢至关重要。蛋氨酸在血管生成过程中发挥重要作用，血管生成是新血管的生长过程。补充蛋氨酸可能对铜中毒有益。然而，许多研究表明，摄入过多的蛋氨酸与癌症生长有关。

Cell Biolabs的蛋氨酸检测试剂盒是一种简单的荧光法检测，用于在96孔微量滴定板格式中测量生物样本中总蛋氨酸的含量。每个试剂盒提供足够的试剂，可进行多达100次检测（包括空白、蛋氨酸标准品和未知样本）。通过与已知浓度的蛋氨酸标准品比较来确定样本中的蛋氨酸浓度。该试剂盒的检测灵敏度为1.5 ?M蛋氨酸。

注意：每个样本重复需要2次检测，一次用S-腺苷蛋氨酸合成酶（+AdoMetS）处理，一次不处理（-AdoMetS）。通过计算两个孔的相对荧光单位（RFU）读数的差异来计算蛋氨酸含量。

艾美捷蛋氨酸检测试剂盒（#MET-5158）检测原理：

Cell Biolabs的蛋氨酸检测试剂盒通过测量生物样本中的总蛋氨酸含量。蛋氨酸和ATP在S-腺苷蛋氨酸合成酶的作用下转化为S-腺苷蛋氨酸、无机磷酸盐和焦磷酸盐。磷酸烯醇丙酮酸和焦磷酸盐在磷酸丙酮酸二激酶的作用下转化为丙酮酸。丙酮酸在丙酮酸氧化酶的作用下，在磷酸盐和氧气的存在下转化为乙酰磷酸、二氧化碳和过氧化氢。随后通过高特异性的荧光探针检测生成的过氧化氢。辣根过氧化物酶催化探针与过氧化氢之间的反应，它们以1:1的比例结合。样本与已知浓度的蛋氨酸标准品在96孔微量滴定板格式中进行比较。样本和标准品孵育30分钟后，使用标准的96孔荧光平板读数器进行读取（图1）。

图1. 蛋氨酸检测原理

蛋氨酸检测试剂盒组分：

盒子1（干冰运输）

1. 蛋氨酸标准品（部件编号51581C）：1支50 ?L试管，浓度为10 mM。

2. ATP（部件编号51583C）：1支50 ?L试管，腺苷三磷酸（ATP）浓度为200 mM。

3. AMP（部件编号51584C）：1支50 ?L试管，腺苷单磷酸（AMP）浓度为20 mM。

4. PEP（部件编号51585C）：1支50 ?L试管，磷酸烯醇丙酮酸（PEP）浓度为100 mM。

5. 荧光探针（部件编号50231C）：1支50 ?L试管，溶剂为DMSO。

6. HRP（部件编号234402-T）：1支10 ?L试管，100 U/mL的甘油溶液。

7. FAD（部件编号50293C）：1支50 ?L试管，黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）浓度为2 mM。

8. TPP（部件编号50294C）：1支50 ?L试管，硫胺素焦磷酸（TPP）浓度为2 mM。

9. 丙酮酸氧化酶（部件编号50295C）：1支300 ?L试管。

10. AdoMetS（部件编号51587D）：1支150 ?L试管，S-腺苷蛋氨酸合成酶（AdoMetS）。

11. PPDK（部件编号51588D）：1支200 ?L试管，磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）。

盒子2（干冰运输）

1. 10X检测缓冲液（部件编号51582A）：1瓶25 mL。

2. Na?HPO?（部件编号51586A）：1支50 ?L试管，磷酸氢二钠（Na?HPO?）浓度为100 mM。

未提供材料：

1. 蒸馏水或去离子水

2. 10 kDa分子量截止（MWCO）离心过滤器（例如Amicon Ultra 0.5 mL）

3. 标准96孔黑色荧光微量滴定板和/或黑色细胞培养微量滴定板

储存：

将10X检测缓冲液和Na?HPO?在室温下保存。将AdoMetS和PPDK在-80?C下保存。将所有其他组分在-20?C下保存。荧光探针对光敏感，必须相应保存。避免多次冻融循环。

样本准备：

- 细胞培养上清液：应避免使用含有丙酮酸的细胞培养基。为了去除不溶性颗粒，以10,000 rpm离心5分钟。收集上清液，并用10kDa离心过滤器过滤溶液以去除蛋白。收集滤液。滤液可以直接用于检测，或根据需要稀释到PBS中。

  注意：维持pH在7到8之间以获得最佳工作条件，因为荧光探针在高pH（>8.5）下不稳定。

- 组织裂解液：在PBS中超声或匀浆组织样本，并在4°C下以10,000 x g离心10分钟。收集上清液，并用10kDa离心过滤器过滤溶液以去除蛋白。收集滤液。滤液可以直接用于检测，或根据需要稀释到PBS中。

- 细胞裂解液：将细胞重悬于PBS中。在冰上匀浆或超声处理细胞。离心去除杂质。收集上清液，并用10kDa离心过滤器过滤溶液以去除蛋白。收集滤液。滤液可以未稀释或根据需要稀释到PBS中用于检测。

- 血清、血浆、唾液或尿液：为了去除不溶性颗粒，以10,000 rpm离心5分钟。收集上清液，并用10kDa离心过滤器过滤溶液以去除蛋白。收集滤液。滤液可以直接用于检测，或根据需要稀释到PBS中。

注意事项：

- 所有样本应立即进行检测，或在-80°C下储存最长1-2个月。根据需要运行适当的对照组。样本的最佳实验条件需由研究者自行确定。始终与样本一起运行标准曲线。

- NADH浓度高于10 ?M和谷胱甘肽浓度高于50 ?M的样本会氧化荧光探针，可能导致错误的读数。为了尽量减少这种干扰，建议在反应中加入超氧化物歧化酶（SOD），最终浓度为40 U/mL（参考文献2）。

- 避免使用含有DTT或β-巯基乙醇的样本，因为荧光探针在硫醇（高于10 ?M）存在时不稳定。

相关产品：

1. MET-5029：丙酮酸检测试剂盒（荧光法）

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蛋氨酸检测试剂盒引用文献：

1. Finkelstein JD (1990). J. of Nutr. Biochem. 1: 228–37.

2. Votyakova TV, and Reynolds IJ (2001) Neurochem. 79:266.

3. Longchamp A, Mirabella T 2, Arduini A, MacArthur MR, Das A, Trevi?o-Villarreal JH, Hine C,Ben-Sahra I, Knudsen NH, Brace LE, Reynolds J, Mejia P, Tao M, Sharma G, Wang R, Corpataux J-M, Haefliger J-A, Ahn KH, Lee C-H, Manning BD, Sinclair DA, Chen CS, Ozaki CK, and

Mitchell JR. (2018) Cell 22:117-129

4. Cavuoto P, Fenech MF (2012). Cancer Treat. Rev. 38: 726–736.

5. Cellarier E, Durando X, Vasson MP, Farges MC, Demiden A, Maurizis JC, Madelmont JC, Chollet P (2003). Cancer Treat. Rev. 29: 489–499.