【文献解读】在高通量测定中使用串联泛素结合实体TUBEs揭示细胞中链特异性泛素化

泛素上的不同赖氨酸参与形成不同的泛素链，其中 K48 连接链主要传导蛋白酶体降解的信号，而其他连接，如 K63 连接链和单个泛素分子（单泛素化）充当 DNA 修复、信号转导和运输等过程的非降解信号。由于泛素化涉及多种不同的信号传导和多种不同的赖氨酸（K6、K11、K27、K29、K33、K48 和 K63）导致截然不同的命运，因此有必要对靶蛋白的泛素化进行分离和仔细研究，以确定蛋白质是否正在从细胞的一个部分降解、稳定或运输到另一个部分。

这篇发表于《Scientific Reports》（2025）的研究文章题为《Unraveling chain specific ubiquitination in cells using tandem ubiquitin binding entities》，由 Progenra 和 LifeSensors 的研究团队合作完成。研究聚焦于泛素-蛋白酶体系统（UPS）中链特异性泛素化的检测技术，特别是利用Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs)来高通量分析内源性蛋白质的泛素化类型。

介绍

泛素化是一种多功能且高度调节的翻译后修饰，涉及将泛素 （8 kDa） 添加到靶蛋白中，影响各种细胞功能，如蛋白水解、细胞周期、DNA 修复、细胞死亡和免疫反应泛素化过程涉及酶级联（E1、E2 和 E3），其中 E3 泛素连接酶选择靶蛋白进行泛素化和降解。人类基因组中编码了 600 多个 E3 连接酶，其中只有一小部分 E3 得到了功能表征。E3 连接酶失调通常会导致中枢神经系统疾病、炎症、代谢功能障碍和多种癌症等疾病的发展。泛素化主要通过8种不同类型的键（M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63）发生，其中K48和K63键研究最广泛。表明不同泛素链连接具有不同功能的初步证据来自涉及泛素 K48 或 K63 突变的酵母突变体的研究，其中发现 K63 连接的多泛素参与 DNA 修复，而 K48 连接的多泛素对蛋白质降解和细胞周期进展至关重要。这些发现确立了特定链键在细胞过程中发挥独特作用的概念。现在已经确定，K48 连接链以蛋白质为目标进行降解，而 K63 连接链调节蛋白质功能、信号转导、亚细胞定位或蛋白质-蛋白质相互作用。K63泛素化参与激活下游信号分子的信号小体的形成，特别是在NF-κB和MAPK通路中。NF-κB激活涉及NF-κB必需调节剂（NEMO）的K63泛素化，促进IKK复合物组装和与炎症相关的基因表达。K63 泛素化还有助于激活参与促炎细胞因子产生的 NLRP3 炎症小体。

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LifeSensors专注于泛素化和蛋白质修饰研究工具开发。LifeSensors凭借SUMO表达系统、TUBEs技术及泛素化检测平台，成为UPS研究领域的核心工具供应商。其产品兼具高灵敏度和特异性，覆盖从基础机制到药物开发的全链条需求，尤其在PROTAC研发和神经疾病研究中展现突破性价值。通过与全球学术机构及药企合作（如辉瑞、罗氏），持续推动靶向治疗创新。

泛素通路研究工具: 

以下为该文献的解读：

研究背景与意义

·泛素化与细胞功能：泛素化是一种重要的翻译后修饰，涉及将泛素（8 kDa）添加到目标蛋白上，影响蛋白酶解、细胞周期、DNA修复、凋亡和免疫反应等多种细胞功能。

·泛素链类型与功能：存在八种不同类型的泛素链连接方式（M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63），其中K48链接的泛素链主要与蛋白酶体降解相关，而K63链接的泛素链则主要参与信号转导和蛋白转运。

·研究目的：本研究旨在利用高亲和力的链特异性TUBEs，在高通量格式中评估PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）或分子胶（MGs）介导的内源性目标蛋白泛素化，特别是RIPK2的泛素化动态。

研究方法

·TUBEs技术：TUBEs（Tandem Ubiquitin Binding Entities）是由多个泛素结合域串联构成的高亲和力泛素结合蛋白，能特异性捕获多聚泛素链。本研究使用了泛选择型TUBEs和链特异性TUBEs（M1-TUBE, K48-TUBE, K63-TUBE）。

·高通量筛选平台：开发了基于96孔板的高通量筛选平台，利用链特异性TUBEs捕获和分析内源性蛋白的泛素化事件。

·实验模型：使用THP1和K562细胞系，通过L18-MDP（一种细菌细胞壁成分）诱导RIPK2的K63泛素化，以及使用RIPK2 PROTAC（RIPK degrader-2）诱导K48泛素化。

关键发现

·L18-MDP诱导的RIPK2 K63泛素化：L18-MDP刺激THP1细胞后，RIPK2的K63泛素化显著增加，这一过程可被K63特异性TUBEs和泛选择型TUBEs捕获，但不被K48特异性TUBEs捕获。

·RIPK2 PROTAC诱导的K48泛素化：RIPK degrader-2（一种基于VHL的PROTAC）能够诱导RIPK2的K48泛素化，进而导致其通过蛋白酶体降解。这一过程可被K48特异性TUBEs和泛选择型TUBEs捕获，但K63特异性TUBEs无法捕获。

·UbiTest验证：使用链特异性去泛素化酶（DUBs）处理捕获的泛素化蛋白，进一步验证K48链的存在。

·药物开发的应用：TUBEs技术不仅有助于理解泛素介导的过程，还能提高PROTACs和分子胶的表征效率，为下一代泛素通路药物的开发铺平道路。

·高通量筛选的潜力：基于链特异性TUBEs的高通量筛选方法为靶向蛋白降解药物的开发提供了强大的工具，能够加速有效分子的识别，并深入理解其作用机制。

LifeSensors专注于泛素化和蛋白质修饰研究工具开发，其明星产品包括：

·TUBEs系列：

· 泛选择型TUBEs：能够非特异性地结合多种类型的多聚泛素链，适用于广泛的泛素化蛋白研究。

· 链特异性TUBEs：如K48-TUBE、K63-TUBE等，能够特异性地结合特定类型的多聚泛素链，用于精确分析泛素化事件的链类型。

·泛素化检测试剂盒：

· Ubiquitin Linkage-Specific ELISA Kits（K48, K63等）

· PROTAC Assay Plate Kit

· UbiTest Kit（用于DUB验证）

·其他相关产品：

· 去泛素化酶（DUBs）

· 泛素激活酶（E1）、结合酶（E2）、连接酶（E3）相关试剂

· 泛素、SUMO、NEDD8等修饰蛋白

这些产品广泛应用于药物筛选、机制研究、生物标志物发现等领域，特别是在靶向蛋白降解（TPD） 和免疫炎症研究中具有重要价值。

LifeSensors凭借其创新的技术和丰富的产品线，在泛素系统研究领域处于领先地位，为科研人员和药物开发者提供了强大的工具和支持。

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