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Jena Bioscience核苷酸原料:DNA/cDNA的半抗原标记--生物素(Biotin)和地高辛(Digoxin)

发布者:艾美捷科技    发布时间:2024-04-02     
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由于其的安全性、稳定性和便利性,半抗原生物素(Biotin)和地高辛(Digoxin)是用于生成用于原位杂交、基因表达分析或电泳迁移率变化实验(Electrophoretic Mobility Shift Assays,简称EMSA)的核酸探针的极为常见标签之一。

这些标签通过标记的核苷酸,可以直接(使用生物素化/地高辛化的核苷酸)或间接(通过合并带有活性基团的核苷酸类似物,随后进行生物素化/地高辛化)酶促反应引入到DNA和RNA中。随后,生物素标记的探针可以通过与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的链霉亲和素、碱性磷酸酶(AP)或荧光染料检测,而地高辛化通常通过HRP或AP修饰的抗体来可视化。

对于大多数应用来说,生物素是首选标签。然而,在某些情况下,生物样本中内源性的生物素可能会干扰检测,导致高背景或甚至假阳性。在这些情况下,建议使用地高辛,这是一种仅在洋地黄植物中存在的类固醇。

Biotin.png

  

核酸标记是通过体外聚合反应实现的,例如聚合酶链反应(PCR)。四种天然脱氧核苷酸(dNTPs)或核苷酸(NTPs)中的一种(或多种)被部分替换为带有连接物的类似物,该连接物将标签连接到核苷酸部分的特定位置。这要求核苷酸类似物与聚合酶以及目标序列兼容。由于这种兼容性取决于:1)被替换的核苷酸类型和连接物附着位置,2)连接物的类型(结构)以及连接物的长度。

理论上,可能存在非常多的类似物。然而,在实践中,这被减少到一组已被证明对大多数都能产生良好标记结果的类似物。特别突出的类似物是在其5位被修饰的尿苷三磷酸,其次是5位被修饰的胞苷三磷酸,以及在7-去氮或N6位置有替换的腺苷三磷酸。关于连接物的类型(结构),脂肪族氨基烯丙基、炔丙基氨基和氨基己基连接物已被证明不会参与Watson-Crick碱基配对,因此能够产生良好的杂交结果。

Watson-Crick.png

  

除了连接物的结构,连接物的实际长度也显著影响探针的产量、标签的结合以及标签可视化的灵敏度和可重复性。一般来说,短连接物会产生丰富的探针产量,但可能会阻碍标签的结合和/或探针表面标签的充分可及性,而长连接物则会增加标签对检测试剂的可及性,但会导致探针产量降低。目标是在结合率和检测效率之间达到合适的平衡,这通常通过使用11个原子或16个原子的连接物来实现。

Biotin-4-dUTP.png

Biotin-11-dUTP.png

Biotin-16-dUTP.png

Biotin-18-dUTP.png

在1 kb的PCR实验中(使用1ng的λ DNA,将TTP替换为生物素-dUTP的比例为0-100%),随后通过Southern Blotting和通过Streptadvidin-HRP检测生物素(Biotin),标签的结合显著依赖于连接物的长度。虽然在这个特定的实验中,4个原子和18个原子的连接物显示出极弱的标记,但Biotin-11-dUTP和Biotin-16-dUTP显示出显著更高的灵敏度,并且能够容忍更广泛的dTTP替换范围。



DNA/cDNA标记(DNA/cDNA Labeling):

通过标准的酶促技术,如聚合酶链反应(PCR)、缺口翻译(Nick Translation)、引物延伸(Primer Extension)或末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase,简称TdT)介导的3'端标记和逆转录(cDNA探针),可以生成随机和定点生物素化/地高辛化的DNA和cDNA探针。DNA探针标记主要通过PCR、缺口翻译或引物延伸进行,并应用于原位杂交或DNA微阵列技术。3'端标记的典型应用包括TUNEL(凋亡的原位定位)或电泳迁移率变化实验(EMSA)实验。逆转录法标记cDNA通常用于基因表达分析的DNA实验中。

cDNA Labeling.png

 

Jena Bioscience提供了多种具有不同连接体长度的半抗原标记的((d)d)NTP类似物,这使得能够为特定应用选择合适匹配的产品。


用于DNA标记的生物素化核苷酸:

DNA标记cDNA 标记
核苷酸货号PCRNT引物延申3' 末端标记RT
dUTP
Biotin-11-dUTPNU-803-BIOX√1,2√2√2√2√2
C5 position
Biotin-16-dUTPNU-803-BIO16√1,2√2√2√2√2
C5 position
dCTP
Biotin-11-dCTPNU-809-BIOX√1,2√2√2√2√2
C5 position
Biotin-16-dCTPNU-809-BIO16√1√2√2√2√2
C5 position
Biotin-14-dCTPNU-956-BIO14-√2√2n/an/a
N4 position
dATP
Biotin-7-dATPNU-835-BIO-√2√2√-n/a
N6 position
Biotin-14-dATPNU-835-BIO14-√2√2n/an/a
N6 position
Desthiobiotin-7-dATPNU-835-Desthiobio-n/a√2n/an/a
N6 position
Biotin-11-dATPNU-1175-BIOX√1,2√2√2n/a√2
7-Deaza position
dGTP
Biotin-11-dGTPNU-1615-BIOXn/an/an/an/an/a
7-Deaza position
ddUTP
Biotin-11-ddUTPNU-1619-BIOX---√2-
C5 position
ddATP
Biotin-11-ddATPNU-1612-BIOX---√2-
7-Deaza position

 

用于DNA标记的地高辛/二硝基苯酚修饰的核苷酸:


DNA 标记cDNA 标记
核苷酸货号PCRNT引物延申3' 末端标记RT
dUTP
Digoxigenin-11-dUTPNU-803-DIGX√1,2√1,2√2√2√2
C5 position
Aminoallyl-dUTP-DNPNU-803-DNP√1n/an/an/an/a
C5 position
ddUTP
Digoxigenin-11-ddUTPNU-1619-DIGX---√2-
C5 position


特殊备注说明:

PCR: Polymerase chain reaction with Taq Polymerase(Taq聚合酶的聚合酶链式反应);

NT: Nick Translation with DNAse I / DNA Polymerase I(DNA酶I/DNA聚合酶I的Nick翻译);

Primer Extension: Primer Extension with Klenow 3'-5'exo-(Klenow 3'-5'exo-引物延伸法);

3'-End Labeling: Incorporation with Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)(掺入末端脱氧核苷酸转移酶(TdT));

RT: Reverse Transcription with Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (MMLV RT)(用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV RT)进行逆转录).

1: in-house tested(内部测试)

2: external reference (see datasheet)(外部参考(见数据表))

n/a: no data available(无资料)

- : not applicable(不适用) 

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Jena Bioscience成立于1998年,由德国马普研究所(MPI)的分子生理学家共同创立。该生物公司致力于为全球科研机构、医院、医学院、制药企业和诊断试剂盒生产企业提供各种研发和临床前生物试剂。凭借其强大的科研实力和前沿的学术研究水平,Jena Bioscience已发展成为一个拥有完整生物试剂产品线、超过7500种产品的跨国企业,为全球50多个国家的客户提供生物试剂服务。

Jena Bioscience的主要产品包括核苷/核酸制品系列(包括合成的类似物)、重组蛋白及蛋白表达系统、点击化学产品系列、在结构学研究方面全面提供晶体筛选试剂盒、优化试剂、工具和各类耗材等。此外,还提供分子生物学和生物化学研究的定制试剂与研究服务。

武汉艾美捷科技有限公司,简称艾美捷,拥有进出口资质和自己的国际物流,与国内外90余家知名的试剂、原料及技术服务供应商深度合作,是国内生物制药企业、诊断企业、跨国药企、各大高校院所采购平台的首选定供应商。

 

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