96孔细胞衰老检测试剂盒--高灵敏荧光定量检测方案

产品概述

由艾美捷代理Cell Biolabs推出的96孔细胞衰老检测试剂盒（荧光法）（货号：CBA-231）专为定量检测细胞衰老标志物--酸性衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性而设计。本试剂盒采用荧光底物法，通过细胞裂解液进行酶活性测定，并支持样品蛋白浓度归一化处理，有效排除细胞数量差异对检测结果的影响。每套试剂盒可完成120次96孔板检测。

检测原理

正常原代细胞在体外培养中经历有限次数的群体倍增后，会进入不可逆的G1期生长停滞，获得衰老表型。衰老细胞特征性地高表达SA-β-Gal，该酶在pH 6.0条件下催化荧光底物产生可定量信号。本试剂盒利用这一特性，以荧光强度反映细胞衰老程度。

试剂盒组分与储存

试剂盒常温运输，收到后请按以下要求储存：

组分 | 规格 | 储存条件

2×细胞裂解液 | 10 mL | 室温

2×反应缓冲液 | 10 mL | 室温

SA-β-Gal底物（20×） | 300 uL | -20℃，避光

终止液 | 25 mL | 室温

操作流程

1. 细胞裂解

吸除细胞培养基

每孔加入200 uL预冷1× PBS洗涤一次，吸除洗涤液

每孔加入100 uL预冷1×细胞裂解液，4℃孵育5分钟

收集裂解液至微量离心管，4℃离心10分钟

取上清即为细胞裂解液

2. 蛋白定量（可选）

建议采用BCA法测定各样品总蛋白浓度，用于后续数据归一化

3. 酶反应

取50 uL细胞裂解液至96孔板

加入50 uL新鲜配制的2×反应缓冲液（含底物）

37℃避光孵育1-3小时

4. 信号检测

取50 uL反应混合物至荧光检测专用96孔板

加入200 uL终止液终止反应

以激发波长360 nm/发射波长465 nm读取荧光值

数据解读与质控建议

1. 阳性对照：建议设置已知衰老细胞（如经诱导处理的原代成纤维细胞）作为阳性对照，确保反应体系正常

2. 背景扣除：使用无细胞裂解液的反应孔作为空白对照，用于扣除背景荧光

3. 归一化处理：将荧光值除以对应样品的蛋白浓度，获得单位蛋白的SA-β-Gal活性，便于不同样品间比较

4. 时间优化：初次实验建议在1、2、3小时分别读取信号，选择信号处于线性范围的检测时间点

配套产品推荐

本试剂盒可与细胞衰老染色试剂盒（CBA-230）配合使用，先以染色法观察衰老细胞形态及分布，再以荧光法定量验证。细胞活力检测试剂盒（CBA-240）可用于排除细胞毒性对衰老检测结果的干扰。

注意事项

底物溶液需避免反复冻融，建议分装储存

所有操作步骤建议在冰上进行，以保持酶活性稳定

荧光检测前确保孔底无气泡，以免影响读数准确性

文献参考

1. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Press.

2. Campisi, J. (2000) In Vivo 14, 183-188.

3. Dimri, G. P., X. Lee, G. Basile, M. Acosta, G. Scott, C. Roskelley, E. E. Medrano, M. Linskens, I.Rubelj, O. Pereira-Smith, M. Peacocke, and J. Campisi. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA92:9363-9367.