BPS Bioscience ADAR1 活性双荧光素酶报告基因 HEK293 细胞系，活力检测方案

ADAR1活性双荧光素酶报告基因HEK293细胞系是一种设计用来同时监测细胞活力和ADAR1（作用于RNA的腺苷脱氨酶）酶活性的HEK293细胞系。这些细胞被改造以表达ADAR1（NM_001111.5）和一个ADAR1报告基因构建体。该构建体包含一个带有终止密码子（UAG）的ADAR1发夹靶标，该终止密码子易受到ADAR1介导的编辑成色氨酸（UUG），位于荧光素酶报告基因的上游。此外，它们在CMV启动子的控制下恒定表达Renilla荧光素酶，这可以用来确定细胞活力（图1）。

该细胞系已通过ADAR1 siRNA处理和ADAR1抑制剂Fludarabine处理进行了验证。

图1：ADAR1活性双荧光素酶报告基因HEK293细胞系的作用机制图示。

ADAR1报告基因构建体包含一个带有终止密码子（UAG）的ADAR1发夹靶标，位于编码荧光素酶的序列上游。在没有ADAR1的情况下，荧光素酶不会被转录，细胞不显示荧光素酶活性。然而，这些细胞被改造以表达ADAR1，将腺嘌呤转换成肌苷，现在编码氨基酸色氨酸（UUG），使得荧光素酶的转录和表达成为可能。因此，ADAR1活性与荧光素酶活性直接相关。Renilla荧光素酶从另一个独立的构建体中恒定表达，因此Renilla荧光素酶活性与细胞数量相关，但与ADAR1活性无关。

背景

ADAR（作用于RNA的腺苷脱氨酶）酶在RNA中执行腺苷到肌苷的碱基编辑，特别针对位于特定双链茎环结构中的腺苷。在健康的未感染细胞中，ADAR1对内源性双链RNA进行A到I编辑以防止其激活下游的dsRNA传感器RIG-I（视黄酸诱导基因I）和MDA5（黑色素瘤分化相关蛋白5），进而激活促炎症反应。ADAR1功能丧失突变导致dsRNA传感器异常激活，并涉及自身免疫性疾病。ADAR1功能障碍也影响癌细胞生长、增殖和对免疫疗法的反应。ADAR1在许多肿瘤类型中表达增加，ADAR1敲除已被证明可以改善对某些免疫疗法的反应，如PD-1（程序性死亡蛋白1）/PD-L1（程序性死亡配体1）阻断，并可绕过肿瘤免疫疗法抵抗机制，使ADAR1成为治疗开发的理想靶标。

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应用

? 监测ADAR1活性。

? 研究化合物对ADAR1活性的影响。

? 同时测量化合物对ADAR1活性和细胞活力的影响。

细胞复苏

1. 在37°C水浴中旋转冷冻细胞瓶大约60秒。细胞解冻后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速将瓶内的全部内容转移到含有10毫升预热的解冻培养基1的管中。

注意：在37°C水浴中放置细胞过久会导致细胞活力迅速下降。

2. 立即以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在5毫升预热的解冻培养基1中重悬细胞。

3. 将重悬的细胞转移到T25或T75培养瓶中，并在37°C、5% CO2培养箱中培养。

4. 培养24小时后，检查细胞附着和活力。更换为新鲜的解冻培养基1，并继续在37°C、5% CO2培养箱中培养，直到细胞准备好传代。

5. 在细胞完全融合之前应进行传代。在第一次传代及后续传代中，使用生长培养基1Y。

细胞传代

1. 吸去培养基，用不含Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基1Y并转移到管中。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在生长培养基1Y中重悬细胞。

4. 按推荐的亚培养比例1:5至1:10每周一次或两次播种到新的培养容器中。

细胞冷冻

1. 吸去培养基，用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤细胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基1Y并计数细胞。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在4°C细胞冷冻培养基（BPS Bioscience #79796）中重悬细胞，浓度约为1 x 10^6细胞/毫升。

4. 将1毫升细胞悬浮液分装到每个冷冻管中。将管放入绝缘容器中缓慢冷却，并在-80°C下过夜储存。

5. 次日将管转移到液氮中进行长期储存。

注意：建议在早期传代扩展细胞并至少冷冻10管细胞以备将来使用。

图：ADAR1活性双荧光素酶报告基因HEK293细胞系中ADAR1活性被ADAR1靶向siRNA抑制。

细胞被转染ADAR1靶向siRNA 24小时。培养基被更换为新培养基，然后细胞再孵化48小时。使用双步荧光素酶（荧光素酶&Renilla）检测系统测量了荧光素酶和Renilla荧光素酶活性。结果以标准化发光（左图）和百分比标准化发光（右图）与未经siRNA处理的细胞（设为100%）进行比较。

BPS Bioscience是一家通过ISO 9001:2015认证的生命科学领域的供应商，公司一直致力于开发药物研发领域的重组蛋白酶、蛋白酶活性/抑制剂筛选试剂盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年创立，从创立至今一直致力于提供药物研发领域的创新解决方案，以推动新的药物发现。公司主要关注的领域包括免疫疗法、表观遗传学、新型冠状病毒、CRISPR、细胞信号转导等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白甲基化转移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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