BPS Bioscience ADAR1 响应型荧光素酶报告基因 HEK293 细胞系：荧光素酶标记的基因调控平台

ADAR1反应型荧光素酶报告基因HEK293细胞系是一种设计用来响应ADAR1酶活性的HEK293细胞系。这些细胞被改造以表达一个ADAR1报告基因构建体，包含一个ADAR1发夹靶标，其带有可被ADAR1介导编辑成色氨酸（UUG）的终止密码子（UAG），位于荧光素酶报告基因的上游（图1）。

该细胞系已通过比较转染ADAR1和ADAR2后的报告基因激活情况进行了验证。这个细胞系已被用于开发恒定表达ADAR1的ADAR1活性荧光素酶报告基因HEK293细胞系（#82239）。

图1：ADAR1反应型荧光素酶报告基因HEK293细胞系的作用机制图示。

ADAR1报告基因构建体由一个带有终止密码子（UAG）的ADAR1发夹靶标组成，位于编码荧光素酶的序列上游。在ADAR1活性存在的情况下，例如转染ADAR1时，腺嘌呤被转换成肌苷，现在编码氨基酸色氨酸（UUG），使得荧光素酶的转录和表达成为可能。在没有转染ADAR1的情况下，荧光素酶不会被转录，细胞显示背景荧光素酶活性。荧光素酶活性与ADAR1活性直接相关。

背景

ADAR（作用于RNA的腺苷脱氨酶）酶在RNA中执行腺苷到肌苷的碱基编辑，特别针对位于特定双链茎环结构（图1）中的腺苷。在健康的未感染细胞中，ADAR1对内源性双链RNA进行A到I编辑，以防止其激活下游的dsRNA传感器RIG-I（视黄酸诱导基因I）和MDA5（黑色素瘤分化相关蛋白5），进而激活促炎症反应。ADAR1功能丧失突变导致dsRNA传感器异常激活，并涉及自身免疫性疾病。ADAR1功能障碍也影响癌细胞生长、增殖和对免疫疗法的反应。ADAR1在许多肿瘤类型中表达增加，ADAR1敲除已被证明可以改善对某些免疫疗法的反应，如PD-1（程序性死亡蛋白1）/PD-L1（程序性死亡配体1）阻断，并可绕过肿瘤免疫疗法抵抗机制，使ADAR1成为治疗开发的理想靶标。

HEK293细胞内源性ADAR1表达水平低，因此这个细胞系非常适合研究ADAR1的遗传工程变体。例如，可以通过转染或转导将ADAR1变体引入细胞并比较其活性。使用荧光素酶作为报告基因允许简单的检测读出，使这个细胞系成为ADAR1研究的有吸引力的细胞系统。

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应用

? 监测表达的ADAR1活性。

? 在细胞模型中比较ADAR1修饰和突变的活性，例如在研究ADAR1衍生物结构与功能关系以及RNA编辑疗法的研究中。

细胞复苏

1. 在37°C水浴中旋转冷冻细胞瓶大约60秒。细胞解冻后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速将瓶内的全部内容转移到含有10毫升预热的解冻培养基1的管中。

注意：在37°C水浴中放置细胞过久会导致细胞活力迅速下降。

2. 立即以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在5毫升预热的解冻培养基1中重悬细胞。

3. 将重悬的细胞转移到T25或T75培养瓶中，并在37°C、5% CO2培养箱中培养。

4. 培养24小时后，检查细胞附着和活力。更换为新鲜的解冻培养基1，并继续在37°C、5% CO2培养箱中培养，直到细胞准备好传代。

5. 在细胞完全融合之前应进行传代。在第一次传代及后续传代中，使用生长培养基1N。

细胞传代

1. 吸去培养基，用不含Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基1N并转移到管中。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在生长培养基1N中重悬细胞。

4. 按推荐的亚培养比例1:5至1:10每周一次或两次播种到新的培养容器中。

细胞冷冻

1. 吸去培养基，用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤细胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基1N并计数细胞。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在4°C细胞冷冻培养基（BPS Bioscience #79796）中重悬细胞，浓度约为1 x 10^6细胞/毫升。

4. 将1毫升细胞悬浮液分装到每个冷冻管中。将管放入绝缘容器中缓慢冷却，并在-80°C下过夜储存。

5. 次日将管转移到液氮中进行长期储存。

注意：建议在早期传代扩展细胞并至少冷冻10管细胞以备将来使用。

验证数据

? 以下实验设计为96孔板格式。在不同的组织培养格式中进行实验时，应适当调整细胞数量和试剂体积。

? 所有条件应在三个副本中进行。

? 实验应包括“ADAR过表达”（通过转染或其他方法引入ADAR1或ADAR2的细胞），“阴性对照”（未添加ADAR1或ADAR2，模拟转染条件）和“背景发光”条件。

图2：转染不同ADAR1亚型的ADAR1反应型荧光素酶报告基因HEK293细胞系中ADAR1报告基因的反应。

细胞转染编码不同ADAR1亚型（ADAR1 p150和ADAR1 p110）或ADAR2的质粒24小时。使用One-Step?荧光素酶检测系统测量荧光素酶活性。结果表示为ADAR1荧光素酶报告基因活性的倍数诱导（与未过表达ADAR的细胞相比）。

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