BPS Bioscience Cas9/GFP 安全港 HEK293 细胞系：安全港位点的基因组编辑

重组稳定HEK293细胞系恒定表达带有FLAG标签的Cas9核酸酶和CopGFP（Pontellina plumata绿色荧光蛋白），这些蛋白已被稳定整合到染色体19上的AAVS1安全港位点。当转染或转导单导向RNA（sgRNAs）时，该细胞系将在目标基因组位点维持双链DNA断裂（DSBs）。

Cas9的表达由CBh启动子驱动，而CopGFP由EF1A启动子驱动。图1中展示的联合DNA片段（CBh-Cas9-bGH Poly A-EF1A-CopGFP-T2A-Puro-SV40 Poly A）使用CRISPR/Cas9技术整合到了AAVS1安全港位点。该构建还含有一个普鲁霉素抗性基因。

通过限制稀释克隆细胞以获得单克隆群体。由于避免了Cas9/GFP在HEK293基因组中随机整合所带来的不良影响，该细胞系的行为类似于亲本HEK293细胞。

背景

人类染色体19上的AAVS1（也称为PPP1R12C位点）是一个经过充分验证的“安全港”位点，用于承载DNA转基因。AAVS1具有开放的染色质结构，并且具有转录能力。最重要的是，通过插入DNA转基因破坏AAVS1位点对细胞没有已知的不良影响。与使用其他方法（如慢病毒感染或细胞转染）获得的随机整合相比，特别针对AAVS1位点是一个主要优势，因为这些方法可能会导致插入性突变或破坏重要基因或细胞过程。GFP（绿色荧光蛋白）呈现绿色荧光，最初在水母Aequorea Victoria中发现。后来在Pontellina plumata中发现了GFP（CopGFP），它具有超亮和快速成熟的特点。荧光蛋白的存在允许通过流式细胞仪或荧光显微镜进行细胞识别和定量，以及在体内进行定位研究，提供简单的检测读出。

作为BPS Bioscience在中国的区域总代理，艾美捷科技强烈推荐BPS Bioscience热销产品Cas9/GFP 安全港 HEK293 细胞系。产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

应用

用于基因敲除、转基因敲入、诱变、转基因整合或其他与基因组编辑相关的应用。

细胞培养协议

细胞复苏

1. 在37°C水浴中旋转冷冻细胞瓶大约60秒。细胞解冻后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速将瓶内的全部内容转移到含有10毫升预热的解冻培养基6的管中。在37°C水浴中放置细胞过久会导致细胞活力迅速下降。

2. 立即以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在5毫升预热的解冻培养基6中重悬细胞。

3. 将重悬的细胞转移到T25或T75培养瓶中，并在37°C、5% CO2培养箱中培养。

4. 培养24小时后，检查细胞附着和活力。更换为新鲜的解冻培养基6，并继续在37°C、5% CO2培养箱中培养，直到细胞准备好传代。

5. 在细胞完全融合之前应进行传代。

细胞传代

1. 吸去培养基，用不含Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入解冻培养基6并转移到管中。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在解冻培养基6中重悬细胞。

4. 按推荐的亚培养比例1:6至1:8每周一次或两次播种到新的培养容器中。

细胞冷冻

1. 吸去培养基，用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤细胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入解冻培养基6并计数细胞。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在4°C细胞冷冻培养基（BPS Bioscience #79796）中重悬细胞，浓度约为2 x 10^6细胞/毫升。

4. 将1毫升的细胞悬浮液分装到冷冻管中。将管放入绝缘容器中缓慢冷却，并在-80°C下过夜储存。

5. 次日将管转移到液氮中储存。

注意：建议在早期传代扩展细胞并至少冷冻10管以备将来使用。

图：通过PCR（聚合酶链反应）稳定整合到AAVS1安全港位点。

在整合的5'端，跨越染色体19上的AAVS1位点和CBh Cas9整合开始的区域通过PCR扩增，预计大小为1.1 kb。在整合的3'端，跨越EF1α GFP-Puro整合和染色体19上的AAVS1位点的区域通过PCR扩增，预计大小为1.2 kb。

BPS Bioscience是一家通过ISO 9001:2015认证的生命科学领域的供应商，公司一直致力于开发药物研发领域的重组蛋白酶、蛋白酶活性/抑制剂筛选试剂盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年创立，从创立至今一直致力于提供药物研发领域的创新解决方案，以推动新的药物发现。公司主要关注的领域包括免疫疗法、表观遗传学、新型冠状病毒、CRISPR、细胞信号转导等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白甲基化转移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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