BPS Bioscience 细胞分化与致癌研究：RANK/NF-κB 荧光素酶报告基因 HEK293 细胞系

RARα荧光素酶报告基因HEK293细胞系是经过工程改造的HEK293细胞，表达受视黄酸反应元件（RARE）控制的条件性萤火虫荧光素酶报告基因，并持续表达全长人类视黄酸受体α（RARα, NM_0.00964）。该细胞系已功能验证，能响应全反式视黄酸（ATRA）刺激。

图1：RARα/RARα荧光素酶报告基因HEK293细胞系中视黄酸依赖性荧光素酶报告基因的激活。

背景：

视黄酸受体（RAR）属于核受体家族，有三种亚型：RARα、RARβ和RARγ。RAR与视黄酸X受体（RXR）异二聚化，并作为转录因子调节正常和恶性细胞的生长和分化。当RAR与其配体结合，全反式视黄酸（ATRA）或9-顺式视黄酸时，RAR/RXR异二聚体结合到目标基因启动子区域的视黄酸反应元件。这会招募共激活蛋白，导致下游目标基因的转录和表达。视黄酸（维生素A的衍生物）信号在胚胎和免疫系统发育中扮演关键角色。RARα的突变可能导致急性早幼粒细胞性白血病（APL），其特征是血液中的前体细胞（早幼粒细胞）积累，以及其他类型的癌症。视黄酸的使用可能在癌症治疗中证明是有益的。

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应用：

- 监测RARα调控的信号通路活性。

- 筛选RARα的激动剂和拮抗剂。

细胞解冻：

1. 在37°C水浴中旋转冷冻细胞瓶大约60秒。细胞解冻后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速将瓶中的内容转移到含有10毫升预热的解冻培养基6的管中。在37°C水浴中放置细胞太久会导致活性迅速丧失。

2. 立即以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在5毫升预热的解冻培养基6中重悬细胞。

3. 将重悬的细胞转移到T25培养瓶中，并在37°C、5% CO2培养箱中培养。

4. 培养48-72小时后，检查细胞活力，更换为新鲜的解冻培养基6，并在37°C、5% CO2培养箱中继续培养，直到细胞准备好传代。

5. 细胞应在达到100%融合前传代。传代时切换到生长培养基6A。

细胞传代：

1. 抽吸培养基，用无Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并按照所用培养容器推荐的体积用0.25% Trypsin/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基6A并转移到管中。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基，并在生长培养基6A中重悬细胞。

4. 按照推荐的次培养比例1:10至1:20每周两次将细胞种植到新的培养容器中。

细胞冷冻：

1. 分离后，以300 x g的速度离心细胞5分钟。

2. 去除培养基，并在4°C细胞冷冻培养基（BPS Bioscience #79796）中重悬细胞，密度约为2 x 10^6细胞/ml。

3. 将1毫升的细胞悬浮液分装到每个冷冻瓶中。将瓶子放入绝缘容器中缓慢冷却，并在-80°C下过夜保存。

4. 次日将瓶子转移到液氮中进行长期存储。

注意：建议扩展细胞并在早期传代时至少冷冻10瓶细胞以备将来使用。

检测培养基：

检测培养基6A。

1. 在种植细胞前24小时，去除生长培养基6A并替换为检测培养基。

2. 将细胞分散并种植约30,000细胞/孔在90 ?l的检测培养基中于96孔白色透明底板中。

3. 在“细胞自由对照”孔中加入90 ?l的检测培养基（用于确定背景发光）。

4. 准备ATRA（每孔10 ?l）：首先在100% DMSO中准备ATRA的库存溶液，浓度为期望最高浓度的2000倍。最终体积为100 ?l。

   在检测培养基中稀释200倍，准备含0.5% DMSO的中间10倍库存溶液。

   在0.5% DMSO的检测培养基中准备ATRA的连续稀释液，浓度比期望的最终浓度高10倍。准备含0.5% DMSO的检测培养基（稀释液）用于对照（稀释液）。

   注意：检测中DMSO的最终浓度不应超过0.1%。

5. 向每个孔中加入10 ?l稀释的ATRA。

6. 向“未刺激对照”孔和“细胞自由对照”孔（背景）中加入10 ?l稀释液。

7. 在37°C、CO2培养箱中培养细胞约16至24小时。

8. 每孔加入100 ?l的ONE-Step?荧光素酶试剂，并在室温下轻轻摇动约15分钟。

9. 使用发光仪测量发光。

10. 从所有孔的发光读数中减去平均背景发光（无细胞对照孔）。通过将ATRA刺激的发光与未刺激对照发光相除，可以计算RARα荧光素酶报告基因表达的倍数诱导。

文献参考：

Petkovich M., et al., 1987 Nature. 330 (6147):440-50.

Allenby J., et al., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 (1):30-4.

Peng Z., et al., 2023 J Immunotherapy Cancer 11 (3): e006325.

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