BPS Bioscience CD40/NF-κB 荧光素酶报告基因 HEK293 细胞系：免疫治疗研究的新模型

重组HEK293细胞系表达全长人类CD40（也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5；TNFRSF5）。通过流式细胞仪和西方印迹确认表达。NF?B荧光素酶报告基因构建体稳定地整合到基因组中。因此，萤火虫荧光素酶基因由位于TATA启动子上游的4个NF-kB响应元件控制。在CD40激动剂激活后，NF-?B转录因子结合到DNA响应元件上，诱导荧光素酶基因的转录。通过测量荧光素酶活性来量化CD40的激活。

CD40/NF-κB荧光素酶报告基因HEK293细胞系示意图

背景

CD40是TNF受体超家族的成员，表达于B淋巴细胞、抗原呈递细胞（APCs）如单核细胞、嗜碱细胞和树突状细胞，以及非免疫细胞如内皮细胞和上皮细胞。该蛋白在几种类型的癌瘤中过表达。CD40与CD4+ T辅助淋巴细胞上的CD40配体（CD40L，CD154）相互作用，触发细胞间粘附分子（ICAM）和其他促炎细胞因子的表达。CD40：CD40L信号增加抗原特异性T细胞的激活。CD40还激活NF-κB依赖的信号，以响应革兰阴性细菌病原体上的脂多糖（LPS）。此外，激动型CD40单克隆抗体激活抗原呈递细胞（APC）并促进抗肿瘤T细胞反应，以及培养具有控制癌症潜力的细胞毒性髓样细胞，即使在缺乏T细胞免疫的情况下。CD40被认为是癌症免疫治疗的潜在靶标。

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应用：

? 筛选和表征CD40的潜在激动剂或抑制剂

? 在细胞系统中研究CD40激动剂和拮抗剂对NK-κB信号的影响

细胞培养协议

细胞解冻

1. 在37°C水浴中摇晃装有冷冻细胞的小瓶大约60秒。细胞一旦解冻（可能比60秒稍快或稍慢），迅速将小瓶的全部内容转移到含有10毫升预温的解冻培养基1（不含庆大霉素或潮霉素）的试管中。如果将细胞在37°C的水浴中放置过久，将导致活性迅速丧失。

2. 立即以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基并用5毫升预温的解冻培养基1（不含庆大霉素或潮霉素）重悬细胞。

3. 将重悬的细胞转移到T25或T75培养瓶中，并在37°C和5% CO2培养箱中培养。

4. 培养24小时后，检查细胞附着和活性。更换培养基为新鲜的解冻培养基1（不含庆大霉素或潮霉素），并在37°C和5% CO2培养箱中继续培养，直到细胞准备好传代。

5. 细胞应在完全融合前进行传代。在第一次传代和后续传代中，使用生长培养基1A（含庆大霉素和潮霉素）。

细胞传代

1. 抽吸培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并用0.05%胰酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基1A并转移到试管中。以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基并用含庆大霉素和潮霉素的生长培养基1A重悬细胞。每周一次或两次按照大约1:5的期望传代比例将细胞种植到新的培养容器中。

细胞冷冻

1. 抽吸培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并用0.05%胰酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基1A并计数细胞。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基并在4°C冷冻培养基（BPS Bioscience #79796，或10% DMSO + 90% FBS）中重悬细胞，细胞浓度约为2 x 10^6个细胞/毫升。

4. 将1毫升的细胞悬浮液分装到每个冷冻小瓶中。将小瓶放入保温容器中缓慢冷却，并在-80°C下过夜保存。

5. 次日将小瓶转移到液氮中保存。

注意：建议在早期传代时扩增细胞并至少冷冻10个小瓶以备将来使用。

图1：CD40/NFkB荧光素酶报告基因HEK293细胞系中人类CD40的表达。

通过西方印迹（左图）使用特定的CD40抗体（Santa Cruz Biotechnology #sc-975）评估CD40蛋白的表达。Calnexin（Cell Signaling Technology #2433）用作加载对照。CD40/NFkB荧光素酶报告基因HEK293细胞用APC标记的抗人CD40抗体（克隆5C3，Biolegend #334323）染色，并通过流式细胞仪分析（右图）。Y轴是细胞数量百分比。X轴是PE的强度。

文献参考：

1. Li G, et al. (2013) Human Genetics in Rheumatoid Arthritis Guides a High-Throughput Drug Screen of the CD40 Signaling Pathway. PLoS Genet. 9: e1003487

2. Pontrelli P, et al. (2006) CD40L Proinflammatory and Profibrotic Effects on Proximal Tubular Epithelial Cells: Role of NF-kB and Lyn. JASN. 17: 627.

3. Moschonas A, et al. (2012) CD40 Stimulates a “Feed-Forward” NF-?B- Driven Molecular Pathway That Regulates IFN-β Expression in Carcinoma Cells. J Immunol. 188: 5521.

BPS Bioscience是一家通过ISO 9001:2015认证的生命科学领域的供应商，公司一直致力于开发药物研发领域的重组蛋白酶、蛋白酶活性/抑制剂筛选试剂盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年创立，从创立至今一直致力于提供药物研发领域的创新解决方案，以推动新的药物发现。公司主要关注的领域包括免疫疗法、表观遗传学、新型冠状病毒、CRISPR、细胞信号转导等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白甲基化转移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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