RhoA G-LISA GTPase激活检测试剂盒-3小时完成RhoA激活定量

背景概述

Rho家族小GTP酶包含至少20个成员，其中Rac1、RhoA和Cdc42是研究最为深入的三种蛋白。与所有小GTP酶一样，Rho蛋白作为分子开关，通过一系列效应蛋白传递细胞信号。该家族参与广泛的细胞响应过程，包括细胞骨架重组、转录调控、细胞迁移、细胞转化及转移等。Rho开关通过在活性GTP结合状态与非活性GDP结合状态之间交替来发挥作用。理解GTP酶激活/失活调控机制具有重要的生物学意义，也是当前研究的热点领域。Rho家族效应蛋白优先识别GTP结合形式的蛋白，这一特性已被实验性地用于开发监测Rho蛋白激活的亲和纯化检测方法。

传统上，该检测采用pull-down方法，即将Rho效应蛋白的Rho-GTP结合结构域（RBD）偶联至琼脂糖珠上，从而对生物样本中的活性Rho进行亲和检测。然而，该方法存在若干缺陷：耗时长、需要大量总细胞蛋白、同时可处理的样本数量有限，且仅能获得半定量结果。由艾美捷代理Cytoskeleton推出的RhoA G-LISA GTPase激活检测试剂盒（发光法）（货号BK121）采用G-LISA格式，有效克服了上述限制。

产品描述与应用场景

本试剂盒适用于检测细胞和组织裂解液中被激活（GTP结合型）的RhoA蛋白。当裂解液量有限时，例如原代细胞培养样本，本试剂盒是理想选择。此外，它还适用于研究RhoA信号通路以及筛选RhoA激活抑制剂。

试剂盒组成

试剂盒提供96次检测所需全部组分，采用条孔板设计，允许单次或多次检测灵活运行。主要组分包括：96孔RhoA-GTP结合板、抗RhoA抗体、HRP标记二抗、RhoA对照蛋白（组成型活性RhoA）、细胞裂解缓冲液（针对维持GTP结合型GTP酶优化）、结合缓冲液、洗涤缓冲液、抗原呈现缓冲液、抗体稀释缓冲液、HRP化学发光检测试剂A和B、Precision Red先进蛋白检测试剂、蛋白酶抑制剂混合物及条孔架。

所需设备与材料

用户需自备细胞裂解液、细胞刮刀、浓硫酸（1 ml）、液氮（用于速冻裂解液）、轨道微板振荡器（至少200 rpm，分别置于4°C和室温）、多孔移液器及微板发光仪。

检测原理与关键特性

RhoA G-LISA检测通过偶联至96孔条板上的效应蛋白Rho结合结构域（RBD）分离活性RhoA/B/C（GTP结合型），随后使用基于发光ELISA的方法和RhoA特异性抗体对结合的RhoA进行检测和定量。

关键特性如下：本检测为定量检测；检测灵敏度在10 pg–1 ng活性RhoA范围内呈线性；检测特异性针对RhoA；每次检测仅需10–50 ug细胞或组织裂解液；整个检测流程约需3小时。

功能优势总结

与传统pull-down方法相比，本试剂盒具有显著优势：定量结果取代半定量数据，灵敏度高，样本输入量低，尤其适合裂解液有限的原代细胞样本；96孔条板格式便于同时处理多个样本，提升实验通量；约3小时的检测流程显著缩短实验周期。这些特性使本试剂盒成为RhoA信号通路研究及抑制剂筛选的高效工具。

文献参考

1. Jaffe, A.B. & Hall, A. 2005. Rho GTPases: Biochemistry and Biology. Ann. Rev. CellDev. Biol. 21, 247-269.

2. Ridley, A.J. & Hall, A. 1992. The small GTP-binding protein rho regulates theassembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors.Cell. 70, 389-399.

3. Ridley, A.J. et al. 1992. The small GTP-binding protein Rac regulates growth factorinduced membrane ruffling. Cell. 70, 401-410.

4. Coso, O.A. et al. 1995. The small GTP-binding proteins Rac and Cdc42 regulate theactivity of the JNK/SAPK signaling pathway. Cell. 81, 1137-1146.