Agrisera NifH|阳性对照/定量标准品：阳性对照与定量标准品的全面解析

固氮酶参与氮向可同化氨的生物固定。

本品为重组蛋白标准品，来源：Nostoc/Anabaena 7120。

作为Agrisera全国总代理，艾美捷科技强烈推荐Agrisera热销产品NifH|阳性对照/定量标准品。产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

NifH|阳性对照/定量标准品：

格式：冻干粉

数量：100微升

复溶：复溶时加入90微升无菌水。请注意，本产品含有10%甘油，可能看起来像液体，但提供时是冻干的。

储存：冻干/复溶后储存于-20°C；一旦复溶，请分装以避免反复冻融。请在打开前短暂离心管，以避免由于冻干物料粘附在管盖或管壁上而造成的任何损失。

测试应用：西方印迹（WB）

推荐稀释：

标准曲线：建议加载3个样本量（0.5、2和4微升）。

对于大多数应用，0.2微克叶绿素的样本量将在这个范围内给出NifH信号。

阳性对照：对于大多数化学发光检测系统，每个孔加载2微升是最佳的。

该标准品已稳定，准备就绪，上凝胶前不需要加热。

请注意，本产品含有10%甘油，可能看起来像液体，但提供时是冻干的。加水后请允许产品几分钟时间溶解。彻底但轻柔地混合。每次使用前请特别注意彻底混合，因为蛋白质在冷冻后会因更密集的层而沉淀。

预期/表观分子量：

34 kDa（由于添加了His标签，比天然蛋白大）

不反应于：目前没有已知的预测反应性例外。

额外信息：

NifH蛋白标准品可以与全球抗NifH抗体结合使用，以定量从广泛的蓝细菌物种中定量NifH蛋白。全球抗体是针对NifH蛋白中发现的高度保守的15个氨基酸序列产生的。

定量西方印迹：详细方法描述，视频教程

额外信息（应用）：

浓度：加入90微升超纯水后，该标准的最终浓度为0.15 pmoles/ul，该试剂已准备好使用并加载到凝胶上。

蛋白标准缓冲液成分：甘油10%，Tris碱141 mM，Tris HCl 106 mM，LDS 2%，EDTA 0.51 mM，SERVA? Blue G250 0.22 mM，酚红0.175 mM，pH 8.5，0.1mg/ml PefaBloc蛋白酶抑制剂（Roche），50mM DTT。

该标准品已准备好加载，不需要任何添加或加热。使用前需要完全解冻并彻底混合。避免剧烈涡旋，因为缓冲液中含有洗涤剂。混合后，在微量离心机中短暂脉冲以收集管盖的物质。

该标准品已稳定，准备就绪，上凝胶前不需要加热。

请注意，本产品含有10%甘油，可能看起来像液体，但提供时是冻干的。加水后请允许产品几分钟时间溶解。彻底但轻柔地混合。每次使用前请特别注意彻底混合，因为蛋白质在冷冻后会因更密集的层而沉淀。

NifH|阳性对照/定量标准品应用示例：

用Agrisera蛋白提取缓冲液PEB（AS08 300）提取的Trichodesmium sp.总蛋白提取物（泳道6-11，负载80 pmol叶绿素）和NifH蛋白标准品（泳道1-5，0.05，0.1，0.3，0.75和1.5 pmol标准品）在4-12%NuPage（Invitrogen）LDS-PAGE上分离，并用PVDF印迹1小时。在室温下搅拌下，在含有0.1%（v/v）吐温-20（TBS-T）的20mM Tris、137mM氯化钠（pH 7.6）中的2%阻断剂中转移1小时后，立即阻断印迹。在室温下搅拌下，将印迹在1:40000稀释的第一抗体中孵育1小时。倾析抗体溶液，短暂冲洗印迹两次，然后在室温下搅拌下在TBS-T中洗涤一次15分钟，洗涤三次5分钟。在室温下搅拌下，将印迹在2%封闭溶液中稀释至1:50000的二抗（抗母鸡IgY辣根过氧化物酶偶联物）中孵育1小时。如上所述洗涤印迹，并根据制造商的说明，用化学发光检测试剂在极端菲莫图检测中显影5分钟。使用CCD成像仪（FluorMax-Bio-Rad）和Quantity One软件（Bio-Rad）获得印迹图像。

注：根据目标蛋白的丰度，使用每条凝胶通道的适度样品负载（通常为0.5至2.5 ug总蛋白）可以实现最佳定量。

定量：当印迹中包含定量标准品时，可以使用可用软件对样品进行定量。使用Bio-Rad QuantityOne软件在Bio-Rad Fluor-S-Max或同等仪器上捕获的图像可以获得出色的定量结果。轮廓工具用于选择定量区域，并减去背景值，得出每个标准品和样品的调整后计数体积。使用上述协议，在目标负载的1-1.5个数量级范围内生成线性标准曲线。值得注意的是，免疫检测通常显示出强烈的S形信号-负载响应曲线，其中低负载的痕量检测区域、伪线性范围和高负载的饱和响应区域。对于免疫定量，样品中的靶蛋白和标准曲线必须落在伪线性范围内。我们使用该协议的总检测范围跨越了2个数量级，但可量化的范围更窄。

定量蛋白质印迹：详细的方法描述。

文献参考：

Levitan et a. (2010). Regulation of nitrogen metabolism in the marine diazotroph Trichodesmium IMS101 under varying temperatures and atmospheric CO concentrations. Environ. Microbiol (Epub ahead of print)

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