Amplite 快速荧光法总巯基定量检测试剂盒（绿色荧光），让检测流程化繁为简

一、巯基检测的生物学意义与技术挑战

巯基（—SH）广泛存在于生物体系中，涵盖游离半胱氨酸、谷胱甘肽（GSH）以及蛋白质中的半胱氨酸残基。准确测定游离巯基含量是研究氧化应激、解毒代谢和细胞 redox 状态的基础性工作。谷胱甘肽作为细胞内最重要的抗氧化剂，其还原型（GSH）与氧化型（GSSG）的比例直接反映细胞对抗氧化损伤的能力。此外，半胱氨酸代谢异常与多种遗传性疾病密切相关——胱氨酸病由溶酶体转运缺陷导致，胱氨酸尿症则为常见的常染色体隐性遗传性氨基酸转运障碍。

然而，目前市售巯基检测试剂盒普遍存在灵敏度不足或操作流程繁琐的问题，难以满足高通量筛选和微量样品分析的需求。

二、检测原理与核心优势

由艾美捷代理AAT Bioquest推出的Amplite 荧光法总巯基定量检测试剂盒（绿色荧光），货号：AAT-5528，采用专有的水溶性非荧光探针 Thiolite Green 520WS。该探针本身无荧光背景，与巯基发生特异性反应后产生强烈绿色荧光信号，激发/发射波长为 490/525 nm（截止滤光片 515 nm）。这一“开启型”荧光设计有效避免了传统淬灭型探针的背景干扰问题，实现了极高的信噪比。

核心性能指标：

-检测限低至 1 pmol（以半胱氨酸或 GSH 计，100 μL 体系对应 10 nM 浓度）

-一步法操作，室温孵育 10 ~ 60 分钟即可完成

-适配 96 孔或 384 孔黑色微孔板，易于实现自动化高通量检测

三、操作流程与关键参数

3.1 仪器与耗材要求

项目 | 规格

检测仪器 | 荧光微孔板读数仪

激发波长 | 490 nm

发射波长 | 525 nm

截止滤光片 | 515 nm

推荐板型 | 实心黑色微孔板

重要提示： 实验前将所有组分恢复至室温。配制后的储备液建议分装单次用量，于 -20℃ 避光保存，避免反复冻融。

3.2 储备液配制

GSH 标准溶液（1 mM）： 向 GSH 标准品（组分 C）小管中加入 200 μL ddH?O，配制成 1 mM（1 nmol/μL）储备液。

Thiolite Green 520WS 储备液（100×）： 向 Thiolite Green 520WS（组分 A）小管中加入 100 μL ddH?O，配制成 100× 储备液。

3.3 标准曲线制备

取 30 μL 的 1 mM GSH 标准溶液，加入 970 μL Assay Buffer（组分 B）中，得到 30 μM（30 pmol/μL）的 GSH 工作液。取该工作液，用 Assay Buffer 进行 1:3 梯度稀释，依次得到 SD7 至 SD1 系列浓度标准品。

> 注意： 稀释后的 GSH 标准溶液稳定性较差，建议配制后 4 小时内使用完毕。

3.4 检测流程

1. 每孔加入 50 μL GSH 工作溶液；

2. 加入 50 μL GSH 标准品或待测样品；

3. 室温孵育 10 ~ 60 分钟；

4. 在 Ex/Em = 490/525 nm 处监测荧光强度增加值。

四、方法学验证与应用建议

灵敏度验证： 本方法在 100 μL 体系中对 GSH 的检测下限可达 10 nM（1 pmol/孔），远优于传统 Ellman‘s 试剂的比色法（通常检测限在 μM 级别），适合低丰度样品分析。

线性范围： 通过 1:3 梯度稀释制备的标准曲线，在 30 μM 至亚 μM 范围内呈现良好线性关系（R? > 0.99），覆盖常见生物样品的巯基浓度区间。

样品适用性： 可同时检测小分子巯基化合物（GSH、半胱氨酸）及大分子蛋白上的游离巯基。若专门针对蛋白巯基定量，推荐使用同系列产品 5529（经蛋白巯基检测优化版）。

五、常见问题与操作要点

1. 还原剂干扰： 样品中含 DTT、β-巯基乙醇或 TCEP 等还原剂时会严重干扰检测，需预先脱盐或稀释至无干扰浓度；

2. pH 敏感性： 反应体系 pH 建议维持在 7.0 ~ 8.0 之间，偏离此范围可能影响探针反应效率；

3. 光稳定性： Thiolite Green 520WS 反应产物具有良好光稳定性，但仍建议避免长时间强光照射；

4. 孵育时间优化： 高浓度样品（>10 μM）孵育 10 分钟即可达到平台期，低浓度样品（<1 μM）建议延长至 60 分钟以保证反应完全。

六、总结

Amplite 荧光法总巯基定量检测试剂盒以“开启型”荧光探针为核心技术，在灵敏度、操作便捷性和通量适应性方面均显著优于传统试剂盒。1 pmol 级的检测限使其适用于干细胞裂解液、亚细胞组分、微量组织活检等珍贵样品的巯基定量分析，为氧化应激研究、药物代谢评估和遗传代谢病筛查提供了可靠的工具。