Amplite 荧光法总NAD和NADH检测试剂盒（红色荧光），兼容微量样本精准定量

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD?）及其还原形式（NADH），是细胞能量代谢和信号转导中至关重要的辅酶。准确、灵敏地测定总NAD和NADH含量，对于研究细胞氧化还原状态、线粒体功能及多种代谢性疾病至关重要。传统的检测方法多依赖340 nm紫外波长下监测NADH的吸光度，这种方法不仅灵敏度有限，且易受生物样品中其他紫外吸收物质的干扰，同时还需要昂贵的石英微孔板，限制了其在高通量筛选和常规实验室中的应用。

为克服上述局限，由艾美捷代理AAT Bioquest推出的Amplite 荧光法总NAD和NADH检测试剂盒（红色荧光） ，货号：AAT-15257，提供了一种优化的解决方案。该试剂盒采用酶循环反应原理，结合红色荧光检测技术，显著提升了检测的灵敏度、特异性和抗干扰能力，可满足现代生命科学研究的严苛需求。

一、 检测原理与核心优势

本试剂盒的检测系统包含特异性识别NAD/NADH的酶循环体系。在该体系中，NAD和NADH被循环放大，产生的信号与待测样本中的总NAD/NADH浓度成正比。与传统紫外法相比，本试剂盒具有以下显著优势：

1. 高灵敏度与特异性：酶循环反应机制使得信号呈指数级放大，能够检测极低浓度的NAD/NADH。同时，系统内的酶对NAD/NADH具有高度特异性，无需从样品混合物中纯化目标物，简化了操作步骤。

2. 极低的背景干扰：该试剂盒采用红色荧光检测模式（激发波长540 nm，发射波长590 nm，推荐截止波长570 nm）。相较于紫外区域，可见红光区域能有效避开大多数生物样本（如细胞裂解液、血清等）的自发荧光和光散射，极大降低了背景信号，提高了信噪比，尤其适用于复杂生物样本的检测。

3. 操作简便、高通量兼容：整个检测流程仅需“混合-孵育-读取”三步，适用于96孔板或384孔板形式，配合荧光酶标仪即可实现高通量快速检测，无需昂贵石英耗材。

二、 实验关键参数与材料准备

为确保实验结果的准确性，请在使用前熟悉以下关键参数和准备工作：

仪器设置：使用具有荧光检测功能的酶标仪，推荐使用黑色实心底板的微孔板以减少孔间串扰。检测参数设定为：激发光（Ex）540 nm，发射光（Em）590 nm，截止波长（Cutoff）570 nm。

试剂解冻：实验开始前，将所有试剂盒组分在室温下完全解冻。

储存建议：未使用的储备液建议分装成单次使用量，并储存在-20°C，避免反复冻融。

三、 溶液配制指南

正确的溶液配制是实验成功的关键。请严格遵循以下步骤：

1. NADH标准品储备液（1 mM）制备：

向NADH标准品（组分C）的小瓶中添加 200 uL 的 1X PBS 缓冲液，充分混匀，即得到浓度为 1 mM（1 nmol/uL） 的NADH标准储备液。

2. 梯度标准品制备（建议现配现用）：

取 10 uL 上述1 mM NADH标准储备液，加入到 990 uL 的 1X PBS 缓冲液 中，混匀，得到 10 uM（10 pmol/uL） 的NADH标准溶液（标记为NS7）。

取NS7溶液，用1X PBS缓冲液进行 1:3 倍比稀释，依次制备得到NS6至NS1系列梯度浓度标准品。

-注意：稀释后的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3. NAD/NADH工作液制备：

将 10 mL 的NADH传感器缓冲液（组分B） 全部加入到含有 NAD/NADH循环酶混合物（组分A） 的瓶子中，充分混合均匀，即得到足量的NAD/NADH工作液。

注意：此工作液配制量足以用于 2块96孔板 的检测，请根据实际用量酌情配制，并注意避光保存。

四、 简要操作流程

试剂盒的整体操作流程非常简洁，概括如下：

1. 加样：在微孔板中分别加入 50 uL 的NADH梯度标准品或待测样品。

2. 加工作液：每孔加入 50 uL 新配制的NAD/NADH工作液。

3. 孵育：在室温下避光孵育 15分钟 至 2小时。孵育时间可根据目标灵敏度进行优化，时间越长，信号强度越高。

4. 读取：使用荧光酶标仪，在 Ex/Em = 540/590 nm（截止波长570 nm）处读取荧光强度。

总结：Amplite 红色荧光法总NAD/NADH检测试剂盒通过创新的酶循环偶联红色荧光技术，成功解决了传统紫外法的灵敏度低和干扰大两大痛点。其“加样-孵育-读板”的简洁流程，配合完备的试剂组分，为研究人员提供了一种即用型、高可靠性且适合高通量筛选的检测工具，可广泛应用于代谢、衰老、神经科学及药物筛选等多个研究领域。