Cy5 单琥珀酰亚胺酯荧光染料（与Cy5 NHS酯化学等效），远红外荧光标记新选择

一、产品概述与核心特性

Cy5 NHS 酯（Cyanine5 NHS ester）是一种远红外荧光标记试剂，与 GE Healthcare 的 Cy5 NHS Ester 化学等效。Cyanine 5 monosuccinimidyl ester [equivalent to Cy5? NHS ester]由艾美捷代理推出AAT Bioquest推出，货号：AAT-151。该染料通过 NHS 酯官能团与蛋白质、多肽及寡核苷酸上的伯胺基团高效偶联，形成稳定的酰胺键标记产物。

一、核心特性参数：

参数 | 数值

分子量 | 855.07 Da

物理形态 | 蓝色粉末（三乙铵盐形式）

溶解性 | 溶于 DMSO 和 DMF

反应基团 | NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）

反应靶点 | 伯胺基团（赖氨酸残基、胺修饰寡核苷酸）

标记效率 | 80–95% 抗体/蛋白质偶联产率

二、光谱特性与检测兼容性

Cy5 属于菁染料家族，其关键光谱参数如下：

参数 | 数值

激发峰 | 651 nm

发射峰 | 670 nm

推荐激发光源 | 633 nm 或 647 nm 激光

兼容滤光片组 | Cy5 滤光片组或 660/20 带通滤光片

作为远红外荧光染料，Cy5 的发射波长位于红光区域，这一特性赋予了其在活体成像中的独特优势：组织穿透深度大，且生物组织在该波段的自身荧光背景极低，可显著提高信噪比。

三、标记反应操作要点

3.1 反应条件

NHS 酯与伯胺的偶联反应在 pH 8.0–8.5 的缓冲体系中效率最高。推荐使用碳酸氢盐缓冲液或 HEPES 缓冲液，避免使用含伯胺基团的缓冲剂（如 Tris、甘氨酸），以免竞争性消耗反应物。

3.2 标记效率控制

Cy5 NHS 酯的偶联产率可达 80–95%，优于多数同类产品。标记完成后需计算标记度并控制在合适范围内，过度标记同样可能引发自淬灭。对于抗体标记，建议 DOL 维持在 2–4 之间以保证抗原结合活性与荧光信号的平衡。

四、典型应用场景

4.1 流式细胞术与细胞分选

Cy5 标记的抗体是流式细胞术中的常用工具。例如，Cy5-CD 系列抗体偶联物可用于细胞表面标志物的高通量筛选，以及基于荧光的细胞分选（FACS），在免疫学研究和临床诊断中广泛应用。

4.2 荧光原位杂交与实时 PCR

Cy5 标记的寡核苷酸探针可用于 FISH 实验，在组织切片或细胞涂片上实现基因位点的可视化定位。与淬灭基团结合后，Cy5-寡核苷酸偶联物可作为 TaqMan 探针用于实时荧光定量 PCR，其远红外发射光谱与常见仪器通道高度兼容。

4.3 活体成像

凭借远红外波段的深层组织穿透能力和低背景干扰特性，Cy5 标记的抗体或多肽可用于小动物活体成像研究，追踪药物分布、肿瘤靶向或炎症部位的分子事件。

五、不同形式的选择指南

除 NHS 酯形式外，Cy5 提供以下衍生物供特定场景选用：

产品形式 | 反应靶点 | 适用场景

Cy5 NHS 酯 | 伯胺基 | 常规蛋白质/抗体/肽段标记

Cy5 马来酰亚胺 | 巯基（半胱氨酸） | 标记含游离巯基的蛋白质或抗体

Cy5 亚磷酰胺 | 5'-羟基 | 寡核苷酸化学合成中的直接掺入

六、相关染料比较与替代选择

Cy5 vs Sulfo-Cy5： 两者化学结构相同，“Sulfo-”前缀源自分子中的磺酸基团（SO??），该基团显著提升了染料的水溶性。非磺酸化形式的 Cy5 在水溶液中溶解度较低，且更易形成聚集体，因此实际应用中磺酸化形式占据主导地位。

Cy5 vs Cy7： Cy7 是同一家族的近红外替代染料，激发峰为 756 nm，发射峰为 779 nm，适用于需要更长波长检测的活体成像场景，与 Cy5 可实现多通道联合标记。

Cy5 vs iFluor? 647： iFluor? 647 在光谱特性上与 Cy5 高度相似，但在水溶性、荧光亮度和光稳定性方面均有提升，且成本更具优势。对于大规模标记项目而言，iFluor? 647 可作为 Cy5 的经济高效替代方案纳入实验设计考量。

七、实验注意事项

1. 复溶后的 Cy5 NHS 酯应分装保存于 -20°C，避光干燥环境，避免反复冻融

2. 反应体系中游离胺类物质会严重抑制标记效率，需确保缓冲液和溶剂不含伯胺

3. 未反应的染料可通过脱盐柱（如 Sephadex G-25）或透析去除

4. 标记产物在常温光照条件下易发生光漂白，操作及保存过程中应注意避光

5. 三乙铵盐形式的设计改善了染料在 DMSO 和 DMF 中的复溶效果，推荐首选 DMSO 进行溶解

综上，Cy5 NHS 酯凭借其远红外光谱特性、高效的标记化学和广泛的应用兼容性，在流式细胞术、活体成像和分子杂交等实验场景中具有不可替代的优势。根据具体需求选择合适的产品形式或光谱相似的替代染料，可进一步优化实验方案的成本与效果平衡。