兔抗PHD2抗体亲和纯化，靶向氧感知主调控酶，适用HIF信号通路与肿瘤缺氧研究

产品概述

本品为艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗PHD2（脯氨酰羟化酶结构域蛋白2）多克隆抗体（货号：A300-322A），经表位特异性亲和纯化，以未标记形式提供。PHD2是氧感知通路中的关键酶，通过催化HIF-1α的脯氨酰羟化修饰，调控细胞对低氧环境的适应性反应。本抗体特异性识别人PHD2蛋白，适用于免疫沉淀和免疫印迹检测，是缺氧信号通路、肿瘤微环境及代谢适应研究的实用工具。

基本规格参数

参数 具体信息

靶标 PHD2（EGLN1/HIF-PH2）

反应种属 人

应用 IP, WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 全IgG

免疫原 位于第1-50氨基酸残基之间的区域

自身抗体亚型 IgG

标记物 未标记

纯度 抗原亲和纯化

抗原种属 人

浓度 1000 ?g/ml （1 mg/ml）

保存温度 2 8 °C

有效期 自收货之日起1年

缓冲液 Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH 7-8，含0.09%叠氮钠

生产与纯化工艺

本抗体的生产采用表位特异性亲和纯化策略：

1. 免疫原设计：针对人PHD2蛋白中第1至50位氨基酸之间的N端区域（参考序列NP_071334.1）。该区域远离C端的催化结构域，有利于特异性识别PHD2而不与其他PHD家族成员发生交叉反应。

2. 免疫程序：使用上述合成肽段对兔进行免疫，诱导产生特异性抗血清。

3. 亲和纯化：将PHD2特异的N端表位肽固定于固相支持介质上，通过亲和层析从抗血清中特异性分离目标抗体。该策略确保抗体仅识别目标表位，减少非特异性背景。

4. 浓度测定：依据比尔定律，1 mg/ml IgG在280 nm波长下的吸光度（A280）为1.4。本品最终浓度为1 mg/ml（1000 ?g/ml）。

表位定位：抗体识别的表位位于人PHD2蛋白的N端前50个氨基酸（NP_071334.1编号）。由于该区域在不同PHD家族成员中特异性较高，本抗体不易与PHD1、PHD3交叉反应，但该信息未在规格中明确验证，建议用户根据实验需要自行确认。

特异性验证

反应种属：人（已验证）。对小鼠、大鼠等种属的交叉反应性未明确提供，建议使用前通过免疫印迹预验证。

识别表位：PHD2蛋白N端区域（1-50 aa）

经免疫印迹和免疫沉淀验证的特异性：与人PHD2特异性结合

潜在交叉反应：PHD2属于EGLN家族，与PHD1/EGLN2和PHD3/EGLN3具有较高的序列同源性（尤其在催化结构域）。本抗体采用N端表位设计，理论上可降低与PHD1/3的交叉反应，但用户在使用时仍建议设置已知表达PHD2、PHD1和PHD3的细胞裂解物作为平行对照。

生物学背景

PHD2（基因符号：EGLN1，GeneID: 54583，UniProt: Q9GZT9）是氧感知通路的核心组分：

结构特征：PHD2属于2-氧戊二酸依赖性双加氧酶家族，包含一个C端的脯氨酰羟化酶催化结构域和N端的MYND型锌指结构域。

核心功能：

氧传感器：PHD2是4种PHD酶（PHD1-4）中对氧浓度最敏感的亚型，在常氧条件下（normoxia）催化HIF-1α蛋白第402和564位脯氨酸残基的羟基化。

HIF-1α降解调控：羟基化修饰后的HIF-1α被VHL（von Hippel-Lindau）泛素连接酶复合物识别，经泛素-蛋白酶体途径降解。低氧条件下，PHD2活性受抑，HIF-1α得以稳定并转位至核内，激活下游靶基因（如VEGF、EPO、GLUT1）的转录。

非冗余功能：PHD1、PHD2和PHD3在组织表达谱和底物选择性上存在差异。PHD2被认为是调控HIF-1α稳定性的主要亚型，而PHD1和PHD3可能在其他底物或特定组织发挥补充作用。

临床意义：EGLN1基因突变与红细胞增多症（ECYT3）相关；PHD2也是多种实体瘤（肾癌、乳腺癌、胶质瘤）中HIF通路异常激活的关键节点，是抗肿瘤药物研发的靶点。

应用与推荐稀释比例

以下推荐稀释比例为起始参考值。需注意，并非所有列出的应用均已在本实验室完成具体验证，建议用户根据样本类型和实验体系进行梯度优化。

应用 推荐用量或稀释比例 备注

免疫沉淀 6 ?g/mg 裂解物 即每毫克总蛋白使用6微克抗体

免疫印迹 1:500 1:2,500 详见下方标准操作条件

免疫印迹标准操作条件（经实验室验证）：

封闭液和抗体稀释液：5% 脱脂牛奶-TBST

一抗孵育：过夜（4°C或室温）

细胞裂解液WB的二抗：使用山羊抗兔IgG（H+L）抗体（货号A120-101P）

免疫沉淀样本WB的二抗：使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体，并在封闭缓冲液中添加5%正常猪血清（货号S100-020），以避免重链交叉信号干扰

免疫沉淀（IP）指南：

每毫克细胞裂解物总蛋白使用6 ?g抗体

建议使用蛋白A/G琼脂糖珠（兔源抗体推荐蛋白A）

裂解缓冲液推荐使用非变性裂解液（如1% NP-40或Triton X-100，不含SDS）以保留蛋白复合物

设正常兔IgG作为同型对照

阳性对照建议：

人源细胞系（如HeLa、HEK293T、HepG2、U2OS）的全细胞裂解物

常氧条件下PHD2表达量相对稳定，但注意PHD2蛋白半衰期较短，建议使用新鲜制备的裂解物

低氧处理样本可作为功能验证对照（HIF-1α稳定化，PHD2表达可能代偿性上调）

阴性对照建议：

使用正常兔IgG替代一抗

使用PHD2敲低（siRNA/shRNA）或CRISPR敲除细胞裂解物

使用与保存注意事项

保存条件：请于2-8°C条件下保存，切勿冷冻。反复冻融会导致抗体变性失效。在指定条件下，自收货之日起1年内稳定有效。

缓冲液成分：本抗体溶于Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液（pH 7-8），含0.09%叠氮钠作为防腐剂。如后续实验涉及对叠氮钠敏感的酶学检测或细胞培养，请通过透析或脱盐柱去除。

稀释缓冲液建议：

WB：使用5%牛奶-TBST

IP：使用裂解缓冲液本身稀释抗体。建议IP实验中抗体与裂解物体积比不低于1:100，以保证有效结合。

分子量信息：人PHD2蛋白的理论分子量约为46 kDa（UniProt Q9GZT9）。在还原性SDS-PAGE中，可观察到约42-48 kDa的条带。若在预测分子量以外位置观察到额外条带，可能为降解产物、翻译后修饰或非特异性条带。