兔抗磷酸化RPA32（S4/S8）抗体亲和纯化，助力DNA损伤筛查、药物评价与高通量实验研究

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的本抗体为兔源多克隆抗体（货号：A300-245A），特异性靶向RPA32（RPA2）亚基上双磷酸化的第4位和第8位丝氨酸（pS4/pS8）。RPA（复制蛋白A）是由70 kDa（RPA1）、32 kDa（RPA2）和14 kDa（RPA3）亚基组成的异源三聚体复合物，在DNA复制、重组和修复中发挥核心作用。RPA32的S4/S8磷酸化由ATM、ATR和DNA-PK在DNA损伤时诱导，是激活DNA损伤检查点和启动修复的关键事件。该抗体使用双磷酸化合成肽免疫后经抗原亲和纯化，未偶联标记，适用于免疫细胞化学/免疫荧光（ICC-IF）、免疫组织化学（IHC）、免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB），且与人、小鼠样本有交叉反应性。以下将从基本参数、免疫原信息、应用条件、储存稳定性及生物学背景等方面进行详细说明。

一、关键规格参数

项目 | 详细内容

靶标 | RPA32 (RPA2) 磷酸化，特异性识别Ser4和Ser8双磷酸化

反应种属 | 小鼠、人类

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

抗体形式 | 完整IgG

免疫原 | 合成双磷酸化肽段，对应人RPA32第4和8位丝氨酸周围区域（参考序列NP_002937.1，GeneID 6118）

亚型 | IgG

偶联物 | 未偶联

纯化方式 | 抗原亲和纯化（使用固定化的磷酸化肽段）

抗原物种 | 人

浓度 | 1000 ?g/mL

缓冲液 | Tris-柠檬酸/磷酸缓冲液，pH 7~8，含0.09%叠氮钠

储存条件 | 2–8 °C

保质期 | 收货后1年

生产流程 | 亲和纯化后，通过Beer定律测定IgG浓度（1 mg/mL IgG在A280下吸光值为1.4）

> 注：0.09%叠氮钠作为防腐剂，在IP后WB使用HRP标记二抗时需注意其抑制作用。建议在IP洗脱或二抗孵育前充分去除叠氮钠。

二、免疫原与特异性

本抗体采用双磷酸化合成肽（模拟人RPA32蛋白第4和8位丝氨酸同时磷酸化状态）作为免疫原。经抗原亲和纯化（使用相同磷酸化肽段固定于固相载体），确保抗体对双磷酸化表位的高特异性。该抗体不识别非磷酸化RPA32，也不识别单磷酸化（仅S4或仅S8）形式，仅特异性检测S4和S8同时磷酸化的RPA32。经验证，该抗体可识别人和小鼠样本中的磷酸化RPA32。建议阳性对照使用经DNA损伤诱导剂（如喜树碱、依托泊苷、电离辐射）处理的细胞裂解液。

三、推荐应用与实验条件

以下稀释度均为起始推荐范围，用户需根据具体实验体系进行优化。

1. 免疫印迹（Western Blot, WB）

稀释度：1:2000 – 1:10,000  

封闭液及抗体稀释液：5%脱脂奶粉-TBST（Tris缓冲盐水+0.1% Tween-20）  

孵育条件：一抗4°C孵育过夜（推荐）  

二抗推荐：  

常规细胞裂解液WB：使用山羊抗兔IgG（重链+轻链）抗体，如货号A120-101P。  

免疫沉淀后WB：为避免变性IP产物中重链（~55 kDa）信号干扰，推荐使用抗兔IgG轻链特异性HRP标记二抗，并在封闭液中添加5%正常猪血清（货号S100-020）以降低背景。  

阳性对照：用0.5 ?M喜树碱处理HeLa细胞1小时，或10 Gy γ射线照射后1小时收集的细胞裂解液。磷酸化RPA32分子量约为32 kDa。

2. 免疫组织化学（IHC）

稀释度：1:500 – 1:2000  

抗原修复：对FFPE（福尔马林固定、石蜡包埋）组织切片，必须使用pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液进行热诱导抗原修复。  

推荐对照：使用未处理组织作为阴性对照，或用λ磷酸酶处理切片验证磷酸化特异性。  

检测系统：适用于显色法（DAB）或荧光法IHC。阳性信号通常定位于细胞核。

3. 免疫细胞化学/免疫荧光（ICC-IF）

稀释度：1:500 – 1:5000  

固定方法：推荐使用甲醛或4%多聚甲醛固定  

通透处理：甲醛固定的细胞建议使用0.1-0.5% Triton X-100进行通透。  

注意事项：建议并行未处理细胞作为阴性对照，DNA损伤诱导后可见核内离散焦点状信号（RPA焦点）。

4. 免疫沉淀（IP）

用量：6 ?g抗体 / mg总蛋白裂解液  

操作建议：  

裂解液推荐使用非变性裂解缓冲液（如NP-40或RIPA，但避免高浓度SDS），并添加磷酸酶抑制剂（如Na3VO4、β-甘油磷酸酯）以维持磷酸化状态。  

孵育条件：4°C旋转孵育2小时或过夜。  

使用Protein A/G琼脂糖或磁珠捕获免疫复合物。  

洗脱后通过WB检测，务必使用抗兔IgG轻链特异性二抗以避免重链干扰。  

阳性对照：经DNA损伤处理的细胞裂解液。

四、储存与稳定性

储存温度：2–8°C，严禁冷冻。反复冻融会导致抗体变性、效价下降。  

运输条件：湿冰运输，收货后请立即按上述温度保存。  

分装建议：若需长期使用，建议分装成小份后存放于2–8°C，避免污染。不可稀释后长期储存。  

有效期：自收货之日起1年。过期产品可能信号减弱，建议重新订购。  

五、使用建议

A300-245A抗RPA32磷酸化（S4/S8）多克隆抗体是一款经过严格磷酸化肽段亲和纯化、验证充分的研究工具，适用于人及小鼠样本的ICC-IF、IHC、IP和WB检测。其双磷酸化特异性确保了在DNA损伤研究中的精准报告。为获得最佳结果，请严格遵循以下要点：  

WB：使用5%奶粉-TBST，一抗过夜孵育。必须设置未处理对照以确认磷酸化特异性。  

IP：严格按6 ?g抗体/mg裂解液用量，裂解液中必须添加磷酸酶抑制剂。  

IHC/ICC-IF：务必进行柠檬酸缓冲液（pH 6.0）热修复（IHC）；甲醛固定后需Triton X-100通透（ICC-IF）。阳性处理后的细胞应呈现核焦点。  

阳性对照：喜树碱（0.5 ?M，1小时）或依托泊苷（25 ?M，1小时）处理的HeLa细胞。