兔抗γ-H2AX抗体亲和纯化，特异性识别，助力DNA损伤与修复研究

一、产品概述

兔抗γ-H2AX抗体亲和纯化（货号：A300-081A）由艾美捷Bethyl Laboratories推出，经抗原亲和纯化，特异性识别组蛋白H2AX在丝氨酸140位点磷酸化的修饰形式（即γ-H2AX）。该抗体广泛应用于免疫细胞化学（ICC）、免疫组织化学（IHC）和免疫印迹（WB），适用于小鼠（Mouse）和人（Human）来源的样本。抗体以未偶联（Unconjugated）的全IgG形式提供，浓度高达1000 ?g/ml，保存于2–8°C条件下，有效期自收货之日起为1年。

二、核心技术规格

参数项 | 具体规格

靶标 | γ-H2AX（磷酸化组蛋白H2AX，Ser140）

反应种属 | 小鼠、人

适用实验 | ICC、IHC、WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

抗体形式 | 全IgG

免疫原 | 围绕丝氨酸140位点的磷酸化多肽

同种型 | IgG

偶联物 | 未偶联

纯度 | 抗原亲和纯化

抗原种属来源 | 人

浓度 | 1000 ?g/ml

储存温度 | 2 – 8 °C

有效期 | 1年

缓冲液 | Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH 7–8，含0.09%叠氮化钠

表位信息：抗体识别的表位定位于人组蛋白H2AX磷酸化丝氨酸140周围区域（参考序列NP_002096.1，GeneID 3014）。该位点的磷酸化是DNA双链断裂损伤的标志性事件。

三、产品制备与质量控制

抗体采用抗原亲和纯化工艺：以固相固定的γ-H2AX特异性表位多肽为配基，从兔免疫血清中捕获特异性IgG，经洗脱、中和及缓冲液置换获得高纯度抗体。免疫球蛋白浓度通过比尔-朗伯定律测定：1 mg/ml IgG在280 nm处的吸光度值为1.4，据此计算实际浓度。

缓冲液体系为Tris-柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液（pH 7–8），并添加0.09%叠氮化钠作为防腐剂。该防腐剂对过氧化物酶偶联检测系统无显著干扰，但在使用HRP标记二抗时无需额外处理。

四、推荐实验应用与稀释比例

4.1 免疫印迹（Western Blot）

推荐稀释范围：1:10,000 – 1:25,000

封闭与抗体稀释液：含5%脱脂奶粉的TBST（Tris缓冲盐+0.1% Tween-20）

孵育条件：一抗4°C孵育过夜（或按照优化条件）

推荐二抗：山羊抗兔IgG（重链+轻链）抗体，货号A120-101P

阳性对照：使用DNA损伤剂（如喜树碱、依托泊苷或电离辐射）处理的细胞裂解液，如HeLa或NIH/3T3细胞。

操作提示：由于γ-H2AX分子量约为15 kDa，电泳时建议使用高分辨率凝胶（如12-15% SDS-PAGE）并延长转膜时间（可使用0.2 ?m PVDF膜）。转膜后需用丽春红染色确认分子量标记转移效果。

4.2 免疫组织化学（IHC）

推荐稀释范围：1:2,000 – 1:10,000

抗原修复：推荐使用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）进行热诱导抗原修复（如微波或高压修复）

样本类型：福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片

检测系统：推荐使用生物素-链霉亲和素-HRP或聚合物标记的HRP二抗系统

阳性对照组织：小鼠或人睾丸组织（减数分裂细胞中DNA双链断裂丰富）或经辐照的肿瘤组织

修复方法：将切片置于柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.0）中，微波高火加热至沸腾后维持15-20分钟，自然冷却至室温，随后进行封闭和一抗孵育。

4.3 免疫细胞化学（ICC）

推荐稀释范围：1:2,000 – 1:10,000

抗原修复：对于FFPE细胞蜡块，同IHC步骤使用柠檬酸盐缓冲液pH 6.0；对于细胞爬片，可使用4%多聚甲醛固定后，经0.5% Triton X-100透化，无需高温修复。

阳性对照：经1 Gy γ射线照射后30分钟的HeLa细胞，或经4 μM喜树碱处理4小时的细胞。

五、产品生物学背景

γ-H2AX 是组蛋白H2AX在其C端丝氨酸140位点（小鼠中为丝氨酸139，对应编号略有不同）发生磷酸化后的形式。H2AX属于组蛋白H2A家族的成员。核心组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）共同形成核小体，构成真核生物染色质的基本结构单元。

γ-H2AX的生物学意义主要体现在：

DNA损伤应答标志物：在DNA双链断裂发生后，磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶家族（ATM、ATR、DNA-PKcs）迅速磷酸化H2AX的丝氨酸140位点。磷酸化的H2AX在断裂位点周围形成肉眼可见的核焦点（foci），每个焦点对应一个或数个DNA双链断裂。因此，γ-H2AX是目前检测DNA损伤最灵敏、最特异的标志物之一。

基因组稳定性维持：γ-H2AX作为信号平台，募集DNA修复蛋白（如MDC1、53BP1、BRCA1等）至损伤部位，促进同源重组或非同源末端连接修复途径。研究表明，H2AX缺失的小鼠表现出基因组不稳定性增加、免疫缺陷和肿瘤易感性升高。

六、应用注意事项

1. 内源性磷酸酶干扰：样本处理过程中需避免内源性磷酸酶对γ-H2AX的去磷酸化。推荐在裂解液中加入磷酸酶抑制剂（如正钒酸钠、β-甘油磷酸酯）。固定后样本（FFPE或细胞爬片）无需额外抑制，因固定过程已失活大多数酶类。

2. 叠氮化钠的影响：抗体缓冲液中含有0.09%叠氮化钠，该浓度可抑制微生物生长，但不影响IHC/ICC检测。若用于HRP直接标记抗体的活细胞实验，需通过透析或凝胶过滤去除叠氮化钠（它会抑制HRP活性）。对于常规WB二抗检测系统，叠氮化钠已被洗涤步骤移除，无影响。

3. 阳性对照的必要性：由于γ-H2AX表达水平在正常细胞中极低（仅在细胞周期S期或自发DNA损伤时有微弱信号），建议每次实验均设置经DNA损伤处理的阳性对照样本，以验证抗体活性和实验操作流程。

4. 存储稳定性：抗体于2–8°C运输和保存，请勿冷冻。反复冻融会导致抗体聚集和活性下降。若需长期保存，可分装后置于-80°C，但应避免反复冻融。