SIRT2直接荧光筛选试剂盒：内置干扰排查，数据更可靠

一、背景与生物学意义

Sirtuins（SIRTs）家族由七种NAD?依赖性III类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）组成，广泛参与衰老调控、炎症反应、氧化应激、肿瘤发生及DNA损伤修复等核心生理病理过程。该家族成员因其亚细胞定位与底物结合位点的差异，展现出多样化的生物学功能。值得注意的是，SIRTs并非仅局限于去乙酰化作用，它们兼具多功能酶特性，还可催化蛋白质的多聚ADP-核糖基化、脱丙二酰化、脱硫辛酰化、磷酸化及泛素化等多种翻译后修饰。

其中，SIRT2 是一种NAD?依赖性HDAC，在中枢神经系统（尤其少突胶质细胞）中高表达，在心脏、骨骼肌、肝脏及肾脏中表达水平相对较低。其亚细胞定位以细胞质为主，但可在细胞核与细胞质之间穿梭，甚至在线粒体中也有分布。功能研究表明，SIRT2参与有丝分裂调控、炎症信号转导、细胞分化及氧化应激应答。其表达或活性失调已被证实与银屑病、肿瘤、神经退行性疾病及肾脏疾病等多种病理状态密切相关，因此成为药物筛选与疾病机制研究的重要靶点。

二、试剂盒原理与检测流程

由艾美捷代理Cayman推出的SIRT2直接荧光筛选试剂盒（货号：700280）提供了一种便捷、灵敏的荧光法，用于体外筛选SIRT2活性调节剂。该检测体系基于两步酶促反应：

第一步（去乙酰化反应） ：将人重组SIRT2酶、特异性SIRT2/SIRT3肽段底物及辅因子NAD?共同孵育。在酶活性作用下，底物发生去乙酰化修饰，从而被“敏化”，为后续显色反应做好准备。

第二步（显色反应） ：加入显色液（Developer），与敏化后的底物作用，释放出稳定的荧光产物。

该荧光产物的信号强度与SIRT2酶活性呈正相关，可通过荧光酶标仪在 激发波长360 nm 和 发射波长465 nm 处轻松读取，实现快速定量分析。

三、干扰物排查方法

在筛选化合物时，待测样品可能对检测体系产生干扰，包括影响酶促显色反应或直接干扰荧光信号。为排除假阳性或假阴性结果，试剂盒提供了荧光干扰验证方案，使用随盒提供的AMC荧光参比物进行测试。具体操作如下：

1. 取20 ?l AMC荧光参比物（Item No. 10010999），用480 ul 1× Assay Buffer稀释，备用。

2. 根据说明书表格，将适量配制好的各反应组分加入相应微孔中。

3. 用封板膜覆盖微孔板，室温孵育10分钟。

4. 去除封板膜，在激发360 nm / 发射465 nm波长条件下读取荧光值。

通过对比添加待测化合物与未添加组的荧光强度，即可判断该化合物是否对荧光检测本身存在干扰，从而指导后续实验数据的合理解读。

四、储存、稳定性与所需设备

储存与稳定性：为保证试剂盒各组分的活性和稳定性，请严格按照说明书中“提供材料”部分指定的条件储存，并在外包装标注的有效期内使用。核心组分建议于 -80°C 长期保存。运输条件方面，美国本土通常采用干冰运输，其他地区可能有所不同。

需要但未提供的实验材料：

1. 具备激发波长360 nm（允许范围350-360 nm）和发射波长465 nm（允许范围450-460 nm）检测能力的荧光酶标仪；

2. 可调移液器及连续分液器；

3. 纯水（玻璃蒸馏水或去离子水均可）；

4. 微孔板轨道摇床。

五、文献参考

1. S?uczanowska-G?abowska, S., Salmanowicz, M., Staniszewska, M., et al. Therole of sirtuins in the pathogenesis of psoriasis. Int. J. Mol. Sci. 24(13), 10782(2023).

2. Jin, Q., Ma, F., Liu, T., et al. Sirtuins in kidney diseases: potential mechanismand therapeutic targets. Cell Commun. Signal. 22(1), 114 (2024).

3. W?troba, M., Dudek, I., Skoda, M., et al. Sirtuins, epigenetics and longevity.Ageing Res. Rev. 40, 11-19 (2017).

4. Wang, Y., Yang, J., Hong, T., et al. SIRT2: Controversy and multiple roles indisease and physiology. Ageing Res. Rev. 55, 100961 (2019).

5. Maxwell, M.M., Tomkinson, E.M., Nobles, J., et al. The sirtuin 2 microtubuledeacetylase is an abundant neuronal protein that accumulates in the agingCNS. Human Molecular Genetics 20(20), 3986-3996 (2011).

6. Xu, C., Liang, Z., Zhong, Y. et al. Sirtuins in macrophage immune metabolism:A novel target for cardiovascular disorders. Int. J. Biol. Macromol. 256, 12870(2024).

7. Grozinger, C.M., Chao, E.D., Blackwell, H.E., et al. Identification of a classof small molecule inhibitors of the sirtuin family of NAD-dependentdeacetylases by phenotypic screening. J. Biol. Chem. 276(42), 38837-38843(2001).