重组人ACC1蛋白：用于DNL限速酶机制研究与AMPK通路交叉验证

1. 产品概述

由艾美捷代理BPS Biosciences推出的重组人乙酰辅酶A羧化酶α（Acetyl-CoA Carboxylase Alpha，ACC1）全长蛋白（FLAG-His双标签）（货号：50202），由Sf9昆虫细胞表达系统生产，覆盖人ACC1完整氨基酸序列（1–2383位）。C端依次携带FLAG标签和6×His标签，经亲和层析纯化。该产品适用于酶动力学研究、抑制剂筛选及选择性谱分析，尤其针对脂肪酸合成通路相关的代谢性疾病药物开发场景。

项目 | 规格

构建体 | ACC1（1–2383端）-FLAG-His

标签 | C端FLAG标签 + 6×His标签

宿主/表达系统 | Sf9昆虫细胞

分子量 | 271 kDa

纯度 | ≥74%

比活力 | ≥58 pmol/min/?g

剂型 | 水相缓冲液

保存稳定性 | -80°C下至少6个月

2. 背景与功能

ACC1是乙酰辅酶A羧化酶（ACC）家族的两个亚型之一，主要分布于细胞质中，在肝脏和脂肪组织高表达。其核心功能是催化乙酰辅酶A ATP依赖性羧化生成丙二酰辅酶A，该反应是从头脂肪酸合成（De Novo Lipogenesis, DNL）的限速步骤。

ACC1的调控机制具有高度复杂性：

磷酸化调控：AMPK（AMP激活蛋白激酶）磷酸化ACC1 Ser79位点导致酶活性抑制，这是细胞能量感受器的核心输出信号；

别构调节：柠檬酸激活ACC1，长链脂肪酰辅酶A反馈抑制，形成经典的底物-产物平衡调控环路；

蛋白互作：通过其BC（生物素羧化酶）和CT（羧基转移酶）结构域形成同源二聚体，二聚化状态直接影响催化效率。

由于乙酰辅酶A处于糖酵解、脂肪酸氧化、氨基酸代谢和胆固醇合成等多条通路的交汇点，ACC1的活性状态对细胞命运决定具有全局影响。ACC1功能异常与以下疾病明确相关：2型糖尿病（胰岛素抵抗下肝脏DNL异常升高）、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD/MASH）、肥胖及相关代谢综合征，以及多种实体肿瘤（三阴性乳腺癌、肝癌、前列腺癌等）——肿瘤细胞依赖ACC1驱动脂质合成以支持快速增殖。

药理价值：小分子抑制剂TOFA（5-tetradecyloxy-2-furoic acid）可通过靶向ACC1的BC结构域完全阻断DNL，已在NAFLD动物模型中显示治疗潜力。靶向ACC1催化结构域或干扰其二聚化的新型抑制剂，被视为代谢性疾病和脂代谢相关肿瘤的潜在治疗策略。

3. 产品设计与质量控制

3.1 构建体设计  

采用全长序列（1–2383），保留所有天然调控位点（磷酸化位点、别构结合域、二聚化界面），确保体外活性测定和抑制剂筛选的生理相关性。C端串联FLAG和His双标签，既提供两种亲和纯化方式（抗FLAG亲和层析或IMAC），也可用于pull-down实验中的标签切换，避免单一标签可能引起的空间位阻效应。

3.2 纯度与活力  

SDS-PAGE鉴定纯度≥74%。需注意该分子量（271 kDa）为大分子量蛋白，常规SDS-PAGE迁移行为可能受三级结构残留影响，建议使用4–12%梯度胶或Tris-甘氨酸延长电泳体系进行评估。  

比活力≥58 pmol/min/?g（采用BPS Bioscience #79315试剂盒测定，通过ADP-Glo?发光法检测酶反应生成的ADP），确保每批次产品的催化功能可追溯。

3.3 缓冲体系  

组成为40 mM Tris-HCl（pH 8.0）、110 mM NaCl、2.2 mM KCl、20%甘油、3 mM DTT及可变浓度FLAG多肽。关键组分说明：  

DTT（二硫苏糖醇）：保护ACC1中关键半胱氨酸残基免受氧化，维持其BC结构域的构象完整性（该结构域含多个对氧化还原敏感的半胱氨酸）；  

甘油（20%）：作为冷冻保护剂和共溶剂，大分子量蛋白在高浓度甘油中可有效防止冷冻聚集；  

FLAG多肽：在纯化过程中用于从抗FLAG亲和柱上竞争洗脱目的蛋白，最终产品中残留的FLAG多肽对酶活性无显著干扰。

4. 使用与保存指南

4.1 操作步骤  

1. 冰上解冻，轻柔混匀（严禁涡旋振荡，271 kDa长链蛋白对剪切应力高度敏感，涡旋可导致二聚体解离或活性丧失）；  

2. 解冻后快速离心（10,000×g，10秒）以收集管壁液滴；  

3. 按单次用量分装，液氮速冻后返回-80°C长期保存；  

4. 避免反复冻融（每轮冻融可导致酶活性损失20–30%，由于大分子蛋白的冰晶损伤效应更为显著）。

4.2 应用建议  

酶动力学：推荐反应体系为50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM MgCl?、2 mM ATP、1 mM DTT、25 mM NaHCO?及乙酰辅酶A梯度（0–500 uM）。反应温度37°C，时间30–60分钟。使用ADP-Glo?或放射性同位素（??C-HCO3固定法）检测产物。  

抑制剂筛选：阳性对照可采用TOFA（IC50≈ 2–10uM，靶向BC结构域）或CP-640186（双重ACC1/ACC2抑制剂）。预孵育步骤（酶+抑制剂，室温，15分钟）后加底物启动反应。  

选择性谱分析：建议与同源ACC2蛋白进行平行比对，因ACC1与ACC2在CT结构域有约75%序列同源性，但组织分布和功能截然不同（ACC2定位于线粒体膜，调节脂肪酸氧化），选择性抑制剂研发中交叉反应性评估至关重要。

5. 注意事项

运输与接收：干冰运输，到货后立即转入-80°C冰箱。避免存放于无监控温度的超低温冰箱或自动除霜冰箱中。  

DTT稳定性：DTT在溶液中易氧化降解，长期保存后若活性下降可考虑补充新鲜DTT至终浓度1–5 mM（在实验体系中）。  

安全性：本品仅供研究用途（Research Use Only），不可用于临床诊断或治疗。  

缓冲液交换：若需去除FLAG多肽或更换缓冲体系，建议使用脱盐柱（如Zeba）在4°C下快速操作，避免透析时间过长导致聚集。

6. 参考文献

1. Sinilnikova, O.M. et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 16 (3), 409-415 (2007)

2. Olsen, J.V. et al., Cell 127 (3), 635-648 (2006)

总结：本产品提供全长、双标签、高比活力的重组人ACC1蛋白，适用于代谢酶调控机制研究及高通量抑制剂筛选。其保留天然调控位点的全长设计和C端双标签配置，为下游实验提供了灵活的检测和操作窗口。严格遵循操作指南，特别是分装保存和避免涡旋，是确保实验数据可重现性的关键。