Biotium-EvaEZ荧光聚合酶活性检测试剂盒的3种活性测定方案

Biotium-EvaEZ荧光聚合酶活性检测试剂盒提供了一种简单易行的在不使用核酸聚合酶的情况下确定核酸聚合酶活性的准确方法放射性同位素。它含有EvaGreen染料和底漆模板dNTP，氯化镁以及Tris缓冲系统中的ROX参考染料（高ROX）。在场时当DNA聚合酶活性降低时，引物将延伸形成双链可以结合EvaGreen染料的产品，从而增加荧光（图1）。荧光增加率与聚合酶活性（见方案B中的示例）。该检测方法已经开发出来用于测量Taq DNA聚合酶活性。它也可以用于其他DNA聚合酶，如Pfu、Vent、Phusion、Bst、Phi29、MMLV、AMV，SuperScript、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Klenow和大肠杆菌DNA聚合酶I。活性测定可以在4°C至75°C。

图1：EvaEZ荧光聚合酶活性测定的示意图概述

图2：EvaEZ荧光聚合酶活性测定的典型反应曲线

艾美捷Biotium-EvaEZ荧光聚合酶活性检测试剂盒（29051）推荐协议：适用于具有基本酶动力学和活性测定知识的研究人员。

协议A描述了如何通过聚合测定荧光变化。

协议B和C描述了两种不同的方法，使用聚合产生的荧光变化来计算聚合酶活性单位。

协议A：通过聚合测量荧光变化。

1. 在冰上的实时定量PCR反应管中组合以下组分：

10 μL 2X EvaEZ聚合酶活性混合液

9 μL H2O

1 μL DNA聚合酶样品

轻轻混合反应组分。

2. 快速将反应管放入实时定量PCR仪器中。在被测试聚合酶的指定温度下运行等温程序（例如Klenow的37°C）60分钟。在通道1（即FAM或EvaGreen的通道）测量荧光。

3. 图2中的线A是实时定量PCR仪器（例如ABI 7900）记录的典型反应迹线。X轴是分钟数；Y轴是荧光。制作一条通过时间0的线B。由聚合酶活性产生的荧光变化的初始速率（荧光单位/分钟）由线B的斜率表示。

注意1：根据使用的仪器，聚合开始时间和开始收集荧光的时间可能有延迟。

注意2：反应也可以在可以准确控制温度的荧光计比色皿或板式读取器中进行。

协议B：基于聚合酶标准测定未知聚合酶样品的活性。

1. 制作已知活性的标准DNA聚合酶的系列稀释。

2. 使用协议A监测每种稀释的荧光。

3. 通过计算曲线初始线性部分的斜率来确定每种聚合酶稀释的荧光增加的初始速率（参见协议A，步骤3和图2）。

4. 将每种标准稀释的初始斜率与标准DNA聚合酶的单位活性绘制对比，生成标准曲线。

5. 使用步骤4中的线性范围作为标准曲线。使用协议A测量未知聚合酶样品的初始速率。

? 如果速率落在标准曲线的线性范围内，使用标准曲线计算未知聚合酶样品的活性。

? 如果速率超出线性范围，调整未知聚合酶样品的浓度，使初始速率进入标准曲线的线性范围。在计算活性时考虑稀释因子。

协议C：基于合成的核苷酸数量测定未知聚合酶样品的活性。

1. 制作未知DNA聚合酶的系列稀释，并根据协议A测量初始速率。

2. 从稀释系列中选择一个在线性响应区域中的酶浓度，并按照协议A描述确定初始荧光变化的斜率。

ΔF = 斜率（荧光单位/分钟）* 60（分钟）

3. 分别，使用饱和酶浓度和无酶对照组按照协议A中描述的程序运行聚合反应。

4. 通过从无酶对照组的第60分钟荧光中减去饱和酶的第60分钟荧光，得出最大荧光变化（ΔFmax）。

在60分钟内，在试剂盒条件下选定浓度的聚合酶合成的核苷酸数量为：

(ΔF/ΔFmax) * 270 pmole

注意：270 pmol是在20 μL EvaEZ反应中饱和酶合成的核苷酸数量。

储存和搬运：

将试剂盒储存在室温下。套件组件自日期起稳定一年按照建议存储时收到收据。结合缓冲液含有离液硫氰酸胍盐，具有刺激性。使用手套和其他合适的使用此试剂盒时的实验室保护。漂白剂与硫氰酸胍混合会产生有害的副产品。请勿将凝胶提取试剂盒中的废物与漂白剂。

检测协议：

在使用前，请确保向洗涤缓冲液浓缩液中加入100%未变性乙醇。对于31030-50，向10 mL洗涤缓冲液浓缩液中加入40 mL乙醇。对于31030-250，向55 mL洗涤缓冲液浓缩液中加入220 mL乙醇。离心步骤应在常规台式微量离心机中以17,900 x g（大约10,000 rpm）进行。

1. 使用干净的锋利工具，如手术刀，切除含有感兴趣DNA片段的琼脂糖凝胶切片。称量凝胶切片，记录重量，并将凝胶切片转移到1.7 mL微量离心管中。

2. 向1体积的凝胶切片中加入3体积的结合缓冲液（100 mg大约等于100 μL）。

3. 在50°C下孵化凝胶切片和结合缓冲液10分钟，或直到凝胶切片完全溶解。在此孵化过程中偶尔漩涡混合将加速溶解过程。

4. 在凝胶完全溶解后检查溶液的颜色。如果是黄色，溶液的pH值适合DNA结合到柱子上。然而，如果溶液呈橙色、红色或紫色，只需向溶液中加入少量3 M醋酸钠pH 5.0，直到颜色恢复为黄色。

5. 为了更有效地回收小于500 bp或大于4 kb的片段，向管中加入1体积的异丙醇并混合。

6. 将样品吸入提供的柱子中，放入收集管中，离心1分钟。如果有多余的样品，只需分几轮处理，确保将额外的样品应用到相应的柱子上。

7. 丢弃流穿液，并将现在含有结合DNA的柱子放回收集管中。

8. 向柱子中加入750 μL洗涤缓冲液（确保已加入乙醇），并离心1分钟。

9. 丢弃流穿液，将柱子放回收集管中。再离心1-5分钟以去除柱子中残留的乙醇。

10. 小心地取下柱子，放入干净的1.5 mL微量离心管中。

11. 向柱子中心加入30-50 μL洗脱缓冲液。孵化1分钟，然后离心1分钟以收集纯化后的DNA。

12. 将洗脱的DNA储存在-20°C。

Biotium-EvaEZ荧光聚合酶活性检测试剂盒文献参考：

1. Irwin H. Segel, I. H. Segel. Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems. 1976.

2. Mao F, Leung WY, Xin X. (2007). Characterization of EvaGreen and the implication of its physicochemical properties for qPCR applications. BMC Biotechnol. 7, 76.

Biotium致力于开发和生产用于生物医学研究的荧光指示剂及其他特殊生化产品。其产品被广泛应用于细胞生 物学、蛋白质组学、分子生物学、免疫学、微生物学、诊断学、生物化学、神经科学、血液流动检测及大规模药物筛选等众多领域。艾美捷科技是Biotium的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。