Jackson抗羊驼 IgG VHH 二抗--科研新助力，应用无限可能

VHH 抗体（纳米抗体）

重链抗体

VHH 抗体（纳米抗体）正迅速被应用于多个领域，包括医学诊断、治疗、生物传感器、结晶伙伴和小分子检测等。VHH抗体来源于骆驼重链免疫球蛋白（IgG亚类2和3）的VHH结构域。通过筛选骆驼科宿主动物（通常是羊驼或骆驼）的 VHH 文库，获得具有目标特异性的 VHH 序列，然后在选定的表达系统中生产重组 VHH（rVHH）。图 1 所示的长 CDR（互补决定区）是 VHH 域的特征，使 VHH 抗体能够进入常规抗体无法到达的抗原位点。

非典型免疫球蛋白

骆驼科动物（羊驼、骆驼等）除了常规的 IgG1 外，还产生两种非典型的免疫球蛋白。IgG2 和 IgG3 被称为重链免疫球蛋白。它们具有单域结合位点（VHH），不包含 CH1 域或轻链（图 1）。

图 1：常规 IgG、重链免疫球蛋白IgG和 VHH 域抗体。插图：VHH 域抗体的空间填充和丝带图（PDB 1MEL），显示 3 个 CDR 环，其中较长的 CDR3 环以橙色显示。

VHH 抗体的优势

-治疗优势：VHH 抗体能够穿过血脑屏障并进入其他难以到达的部位，因此可用于药物递送。它们在血液中清除迅速，对人类相对无免疫原性。良好的稳定性使其可通过多种途径递送，包括静脉注射、皮下注射、鼻吸入和口服。

-框架：12-15 kDa 的抗原结合 VHH 域作为重组抗体生产的框架。VHH 抗体可以设计成多种结构形式。

-靶向：VHH 抗体的小尺寸和长 CDR3 环使其比传统抗体更容易接近隐蔽的表位。

-稳定性：VHH 抗体具有良好的溶解性，对热、蛋白酶和极端 pH 值稳定。

-生产：VHH 抗体易于克隆和修饰。它们可以在细菌、酵母和哺乳动物表达系统中以高水平重组生产。其设计可以包括用于纯化的标签，或用于添加药物或荧光探针的功能基团。

抗 VHH 抗体

Jackson 抗羊驼二抗旨在优化检测源自骆驼科动物（羊驼和骆驼）的抗体。其开发了多种试剂，以促进通过多种技术识别 VHH 抗体，包括：

-酶联免疫吸附试验（ELISA）

-免疫印迹（Western Blotting）

-流式细胞术（Flow Cytometry）

-免疫荧光（Immunofluorescence）

多克隆二抗的效用在于其能够识别目标（一抗）免疫球蛋白上的多个表位。通过用羊驼的 VHH 片段（从纯化的重链免疫球蛋白中获得）免疫山羊，获得抗 VHH 域抗体。我们已经证明，这些多克隆抗体能够稳健地识别羊驼和骆驼 VHH。然而，一些重组 VHH 可能不会显示许多存在于天然 VHH 片段上的抗原，这使得这些二抗难以检测。

多功能检测 VHH 抗体，不受物种或形式限制

重组纳米抗体通常是从羊驼或骆驼重链抗体的 VHH 结构域框架中生成的。JIR 抗羊驼 VHH 结构域抗体旨在检测骆驼科物种在天然和变性条件下的 VHH 框架。WB（图 2）显示，抗羊驼 VHH 在变性状态下检测到羊驼和骆驼的 VHH 框架。迁移的差异反映了 VHH 抗体结构的差异，特别是 VHH 二聚体 L4*。

如酶联免疫吸附试验（图 3）所示，抗羊驼 VHH 抗体识别羊驼和骆驼 rVHH 的天然形式。不同 rVHH 构建体的信号强度不同，表明某些 rVHH 并未表达存在于免疫原（来自未免疫羊驼的 VHH 片段）上的表位。

图 2：不同羊驼和骆驼 rVHH 域抗体的西方印迹。在还原条件下，纯化的 rVHH（每孔 1μg）经 PAGE 电泳并转移到硝酸纤维素膜上。用牛血清白蛋白（BSA，货号 001-000-162）封闭印迹，并以 1:20K 稀释的辣根过氧化物酶偶联羊抗羊驼 VHH（128-035-232）进行探针检测。使用 ECL 进行检测。

图 3：通过 ELISA 检测来自羊驼或骆驼的 VHH 抗体。每种 rVHH 以 10 μg/ml 涂布于 ELISA 板，并用辣根过氧化物酶偶联羊抗羊驼 VHH（128-035-230 或 128-035-232）和 TMB 底物进行检测。

在大多数情况下，128-035-232 比 128-035-230 提供更强的信号，因为它对较少物种进行了交叉吸附。选择抗体特异性时应考虑预期应用：如果物种交叉反应不是问题，则使用 128-035-232 以获得更高的灵敏度。

间接检测以增强信号

在 VHH 抗体与其靶标结合后，使用二抗进行检测是标记导向检测的替代方法。二抗提供信号增强和更多的偶联选项。

免疫分析格式分析可以设置为多种形式，包括直接、间接、夹心和竞争。间接和夹心分析是更常用的格式。它们通过偶联二抗增强来自目标分子的信号，从而提供更高水平的灵敏度。

图4 A：通过 ELISA 检测羊驼 rVHH 抗人 IgG 一抗。将纯化的重组 GFP（rGFP）以 10 μg/ml 涂布于 ELISA 板。用牛血清白蛋白（BSA，货号 001-000-162）封闭孔，并用几种 rVHH 抗 GFP 一抗的连续稀释液进行探针检测。用辣根过氧化物酶偶联羊抗羊驼 VHH（128-035-232）和 TMB 底物检测一抗。

图 4 B：显示检测羊驼 rVHH 抗 GFP 一抗的WB。两种不同的纯化 rGFP（每孔 0.5 μg）在还原条件下经 PAGE 电泳并转移到硝酸纤维素膜上。用牛血清白蛋白（BSA，货号 001-000-162）封闭印迹，并用 rVHH 抗 GFP 一抗进行探针检测，然后用 1:10K 稀释的辣根过氧化物酶偶联羊抗羊驼 VHH（128-035-232）进行孵育。使用 ECL 进行检测。

在生物样本中检测 VHH

VHH 开发的筛选阶段以及下游应用可能需要检测。与在 VHH 的 N 端或 C 端添加标签相比，使用特定于 VHH 的二抗进行直接检测在许多应用中具有优势。例如，使用抗 VHH 域抗体可以避免通过 His6 等纯化标签进行检测，减少与具有标签表位同源性的内源性蛋白的背景信号。

在WB中，羊驼 VHH 抗体能够在其他蛋白存在下特异性地检测 rVHH。与抗 His6 抗体相比，羊驼 VHH 抗体在检测细胞培养上清或细胞裂解液中的重组蛋白时显示出显著较少的非特异性检测（图 5）。在纯化前筛选或定量 VHH 表达的能力加快了发现和生产进程。然而，VHH 相对于细胞裂解液中的总蛋白的量可能非常小，使得可靠表征变得困难。通过靶向 VHH 域，抗羊驼 IgG VHH 域抗体消除了猜测或标签的需求。如图 6 所示，这些多克隆抗体能够在细胞裂解液中以高灵敏度和特异性检测 VHH。

图 5：比较大肠杆菌裂解液中目标蛋白检测的WB。大肠杆菌裂解液蛋白在还原条件下经 PAGE 电泳并转移到硝酸纤维素膜上。用牛血清白蛋白（BSA，货号 001-000-162）封闭印迹，并以 1:5K 稀释的辣根过氧化物酶偶联抗 His6 抗体或辣根过氧化物酶偶联羊抗羊驼 VHH（128-035-232）进行探针检测。使用 ECL 进行检测，并同时成像印迹。泳道 1：仅 20 μg 大肠杆菌提取物；泳道 2：含 rVHH 表达的大肠杆菌提取物（占总蛋白的 5%，即 1 μg）；泳道 3：含 rVHH 表达的大肠杆菌提取物（占总蛋白的 1%，即 0.2 μg）。

图 6：显示在大肠杆菌蛋白裂解液中检测 rVHH 分析物的夹心 ELISA。将 AffiniPure? 羊抗羊驼 VHH（128-005-232）涂布于 ELISA 板作为捕获抗体，随后加入纯化 rVHH 标准品或含 rVHH 分析物的大肠杆菌裂解液（占总蛋白的 1% 或 5%）。用辣根过氧化物酶偶联羊抗羊驼 VHH（128-035-232）和 TMB 底物检测 rVHH。

流式细胞术检测 VHH

重组 VHH 构建体可能成为治疗应用的候选者，因此需要在动物模型或患者中追踪它们的存在。山羊抗羊驼 VHH 抗体（例如，Alexa Fluor 488 偶联 128-545-230）可用于检测患者细胞上的 VHH，而不会识别内源性 IgG 或源自小鼠、兔或大鼠的一抗。

目前的肿瘤学研究在多种 T 细胞重定向策略中采用 VHH 技术，以利用患者自身的免疫防御。这些策略包括生成双特异性格式以招募和激活细胞毒性或 γδ T 细胞，设计基于纳米抗体的嵌合抗原受体（CAR）T 细胞，以及开发免疫检查点阻断纳米抗体。通过流式细胞术对修饰的 T 细胞进行表征，通常允许分选和扩增表达 CAR 的细胞。

图 7：使用羊驼 VHH 抗人 IgG 和 Alexa Fluor 488 羊抗羊驼 VHH 间接检测淋巴细胞上的人 IgG。

我们使用多克隆羊驼 VHH 抗人 IgG（而非 CAR）来展示 128-545-230 在流式细胞术中的效用。相邻的图代表在淋巴细胞上设置的样本。羊抗羊驼 VHH 不识别小鼠抗 CD19，并且仅在存在 VHH 抗人 IgG 时检测人 IgG。

使用 VHH 抗体进行成像

使用 VHH 抗体进行检测需要荧光探针或酶等报告分子来可视化目标蛋白。偶联的山羊抗羊驼 VHH 抗体提供了间接检测的固有优势，如信号增强和偶联选择。

抗羊驼 IgG 二抗

图 8：HEp-2 细胞的 Ki-67 和微管双重标记。HEp-2 细胞采用以下组合进行染色：兔抗 Ki-67，羊驼抗兔多克隆 VHH，以及 Alexa Fluor 488 偶联山羊抗羊驼 IgG VHH 域（128-545-230）（绿色）；小鼠抗微管和 RRX 偶联山羊抗小鼠 IgG（115-295-146）（红色）。使用 DAPI 进行核染色（蓝色）。

山羊抗羊驼 IgG VHH 域（最少牛、人、小鼠、兔和大鼠血清蛋白）已对常见宿主物种进行交叉吸附，以最小化背景和非靶标标记。

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