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Comet Assay Kits 彗星分析试剂盒说明书

发布者:艾美捷科技    发布时间:2021-02-22     
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艾美捷科技,Cell Biolabs中国区总代理  

 

产品名称货号规格说明
Comet Assay Kits, 3-Well (3孔玻片)
(最常用)
STA-35015 assays(5片)

STA-350.png

STA-35175 assays(25片)
STA-351-55*75 assays(5*25片)
Comet Assay Kits, 96-Well(96孔玻片)
(高通量筛选)
STA-35596 assays(1片)

STA-355.png

STA-355-55*96 assays(5片)

 

Comet-Assay-Kits-1.png

 

     *为方便客户使用试剂盒,艾美捷科技善意将其翻译成中文操作手册,请以试剂盒中配套的英文版为准。因编者翻译水平有限,对于由本说明书中不当翻译所造成的损失,概不负责,如有错误,欢迎指正!

     本说明书对应英文链接:https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/STA-350-comet-assay-kit.pdf

 

实验开始前,建议先通读说明书(请以试剂盒中配套的英文版为准):

 

      介绍:由于环境因素和细胞内正常的新陈代谢过程,DNA损伤每天以每个细胞1000到100万个分子损伤的速度发生。虽然这只占人类基因组约60亿个碱基(30亿个碱基对)的一小部分,但关键基因的未修复损伤可能会阻碍细胞发挥其功能的能力,并显著增加癌症的可能性。彗星实验(Comet assay)也被称为单细胞凝胶电泳实验(Single cell gel electrophoresis,SCGE),是一种超灵敏的单细胞水平上检测DNA损伤的技术。在电泳场下,损伤的细胞DNA(包含碎片和链断裂)从完整的DNA中分离出来,在显微镜下形成典型的“彗星尾巴”形状。DNA损伤的程度通常是通过测量彗星尾巴来目测的,也可以使用图像分析软件来测量各种参数。

 

     OxiSelect™ Comet Assay是一种快速、灵敏的,用于测量细胞DNA损伤的试剂盒。每个试剂盒提供足够的试剂,最多可进行15次检测。

 

     OxiSelect™ Comet Assay实验原理:Cell Biolabs 的 OxiSelect™ Comet Assay 是一种单细胞凝胶电泳法 (SCGE),用于简单评估细胞 DNA 损伤。首先,将单个细胞与低熔点琼脂混合后,再应用到OxiSelect™ Comet特制玻片上。然后,用裂解缓冲液和碱性溶液处理这些嵌入的细胞,使DNA松弛并变性。最后,在电泳槽中对进行电泳,以分离完整的DNA和受损的片段。电泳后,样品被干燥,用DNA染料染色,并通过外显荧光显微镜可视化。在这些条件下,受损的DNA(包含裂解和链断裂)将比完整的DNA迁移更多,并产生 "彗星尾 "形状(见图1)。

 

Comet-Assay-Kits-1.jpg

图1,彗星实验原理与流程示意图

 

试剂盒组分(以STA-350,3孔板为例):

 

组分组分编码规格
OxiSelect™ 3-Well Comet Slides
特制3孔玻片(表面处理)
STA-3525片(每片上有3孔)
OxiSelect™ Comet Agarose
彗星实验专用低熔点琼脂糖胶
23500215ml(1瓶,无菌)
Vista Green DNA Dye, 10000X
绿色荧光DNA染料,10000X
2350035ul(1支)
EDTA Solution, 500 mM
EDTA溶液,500mM
23500450ml(1瓶)
10X Lysis Solution
10X 裂解液
23500520ml(1瓶)

 

     客户自备材料:

     1.氯化钠粉末

     2.NaOH颗粒

     3.10 N NaOH,用于调整pH值 (10 N NaOH = 10 M NaOH =10 mol/L NaOH)

     4.DMSO(可选)

     5.70%乙醇

     6.TE缓冲液(10mM Tris,pH 7.5,1mM EDTA)。

     7.PBS(不含Mg2+和Ca2+)。

     8.EDTA(二钠盐)

     9.DI H2O(去离子水)

     10.37ºC和沸水浴

     11.水平电泳槽

     12.可调节的单通道微量移液器,带一次性吸头。

     13.带FITC过滤器的外显荧光显微镜

 

     保存条件:收到试剂盒后,将绿色荧光DNA染料,10000X存放在-20ºC。 所有其他试剂盒组件在室温下储存。

 

《实验步骤》以STA-350,3孔板为例

 

     为方便客户使用试剂盒,艾美捷科技善意将其翻译成中文操作手册,请以试剂盒中配套的英文版为准。因编者翻译水平有限,对于由本说明书中不当翻译所造成的损失,概不负责,如有错误,欢迎指正!本说明书对应英文链接:https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/STA-350-comet-assay-kit.pdf

     一、试剂准备:

 

     1.OxiSelect™ CometAgarose将Comet Agarose瓶放在90-95ºC水浴中加热20分钟,或者直到琼脂胶液化。将瓶子转移到37℃的水浴中20分钟,并保持直到使用。

 

     2.1X Vista Green DNA Dye工作液:使用TE缓冲液(10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA)稀释原10000X的Vista Green DNA Dye母液,按照1:10000的比例,稀释成1X的Vista Green DNA Dye工作液。1X工作液可在4℃避光条件下保存3周。

 

     3.Lysis Buffer: 准备100ml的1X 裂解缓冲液

 

NaCl14.6 g
EDTA Solution (试剂盒提供)20ml
10X Lysis Solution (试剂盒提供)10ml
DMSO10ml(样品中含血红素,则加入)
DI H2O(去离子水)调整体积到90ml
充分混合以溶解NaCl。缓慢加入10 M的NaOH来调节Lysis Buffer的pH值到10.0,最后再使用去离子水调整体积,定容到100ml。冷藏裂解液到4℃,直到使用。
* Note: 缓冲液在室温下会看起来浑浊,但在4ºC时会变清。pH也会保持在约10.0。

 

     * 血红素在4℃成胶状,用DMSO溶解的血红素。DMSO的添加是任选的,仅对含有血红素的样品(例如血细胞或组织样品)是必需的。加入DMSO对实验结果没有影响。

     4.Alkaline Solution准备100ml的碱性溶液

 

NaOH1.2g
EDTA Solution (试剂盒提供)0.2ml
DI H2O(去离子水)调整体积到100ml
充分混合以溶解NaOH。冷藏碱性溶液到4℃,直到使用。

 

    5.Electrophoresis Running Solution: 准备1L电泳缓冲液,需求选择电泳模式(二选一)

 

电泳模式检测类型电泳时间说明
TBE电泳(中性电泳)检测单链双链DNA的断裂推荐
10-15 mins
分析细胞凋亡的首选方法,可使用尾巴长度而非尾矩进行数据分析。
碱性电泳检测单链双链DNA的断裂,AP位点损伤在内的所有DNA 损伤推荐
15-30mins
灵敏度最高!

 

     * 实验过程中的各类缓冲液都需要4℃预冷。

 

     5.1 TBE Electrophoresis Solution (中性)

 

Tris Base10.8g
Boric Acid5.5g
EDTA(二钠盐)0.93g
DI H2O(去离子水)调整体积到1L
充分混合以溶解固体颗粒。冷藏TBE电泳缓冲液到4℃,直到使用。

     或者5.2 Alkaline Electrophoresis Solution (300 mM NaOH, pH >13, 1 mM EDTA)(碱性)

 

NaOH12g
EDTA Solution (试剂盒提供)2ml
DI H2O(去离子水)调整体积到1L
充分混合以溶解NaOH。冷藏碱性电泳缓冲液到4℃,直到使用。

     特殊说明:为避免紫外线对细胞样品造成额外损害,请在弱光条件下进行实验。

     二、准备样品和玻片:

 

     1.准备裂解缓冲液、碱性溶液和电泳缓冲液(见试剂准备),然后再进行实验。将所有溶液彻底冷却至4ºC

 

     2.将OxiSelect™ Comet Agarose放在90-95ºC水浴中加热20分钟,或者直到琼脂胶液化。将瓶子转移到37℃的水浴中20分钟进行冷却,并保持直到使用。

 

     3.在OxiSelect™ Comet玻片上,每孔加入75 ul 37℃的Comet Agarose,形成基层胶用移液器将胶溶液涂抹在孔上,确保完全覆盖和平铺。将载玻片转移到4ºC下水平放置15分钟,使其固化。

 

     4.按照如下方式准备细胞样品,与对照细胞:

 

     悬浮细胞:以700×g离心2mins,弃上清,用冰冷的PBS(无Mg2+和Ca2+)洗涤细胞一次,离心,弃上清。最后,用预冷4℃的PBS(无Mg2 +和Ca 2 +)重悬细胞到1×105个细胞/ml 。

 

     贴壁细胞:轻轻地从细胞培养瓶/培养皿中取出细胞,用橡胶细胞刮处理。将细胞悬浮液转移到锥形管(EP)中,并在700×g离心2mins,弃上清。用冰冷的PBS(不含Mg2+和Ca2+)洗涤细胞一次,离心,并丢弃上清液。最后,用预冷4℃的PBS(无Mg2 +和Ca 2 +)重悬细胞到1×105个细胞/ml 。

    

     组织样品:使用解剖剪刀,切碎一小块组织到1-2ml冰冷的含20mM EDTA的PBS缓冲液(无Mg2 +和Ca 2 +)。组织/细胞悬浮液放置5分钟,然后将上清液转移到离心管中,避免转移碎片。700×g离心2mins,丢弃上清液。最后,用预冷4℃的PBS(无Mg2 +和Ca 2 +)重悬细胞到1×105个细胞/ml 。

 

     * 推荐阳性对照:使用20 uM Etoposide(依托泊苷)处理4小时。

 

     5.将细胞悬液Comet Agarose(步骤2)以1:10的比例(v/v),用移液枪混合均匀,并立即转移75ul 到每个孔中的原基层胶上方(步骤3)。确保完全覆盖平铺孔板,非常轻柔和小心地用移液管尖传播的悬浮液,而不干扰基层胶

 

    Note: 对于多个样品的处理,将细胞与Comet Agarose混合液保持在37℃,避免凝胶化。准备好样品后,重新混匀,依次取出75ul加入到玻片孔中。

 

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    发表文献

 

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