LifeSensors：TUBE1-AlexaFluor647 荧光标记试剂盒

一、技术背景

1. 泛素-蛋白酶体系统（UPS）生物学基础

泛素是一种小分子多肽，可通过E1-E2-E3三级酶级联反应共价结合到底物蛋白的赖氨酸残基上，形成单泛素或多聚泛素修饰，其中K48、K63连接的多聚泛素链是研究最充分的类型：K48连接的多聚泛素化通常介导底物被蛋白酶体降解，而泛素化修饰可被去泛素化酶（DUB）逆向去除，该动态调控过程的复杂性是泛素化蛋白功能研究的主要障碍[1]。

2. 技术研发需求

人类基因组编码数百种E3连接酶，调控数千种底物蛋白的泛素化过程，E3功能异常与癌症、神经退行性疾病、心血管疾病、代谢疾病密切相关，是新药研发的重要靶点，但目前缺乏适用于高通量筛选的E3连接酶底物泛素化检测工具。

3. TUBEs技术基础

TUBEs（串联泛素结合实体）整合了多个泛素结合结构域（UBD），对泛素链具有亚纳摩尔级亲和力，相比泛素抗体灵敏度、特异性更高，可识别多种泛素链结构，适用于ELISA、TR-FRET均相E3连接酶活性检测、免疫印迹、蛋白质组学、荧光成像等多种实验场景，是UPS研究的多功能亲和工具。

二、应用领域及基于TR-FERT技术检测原理

1.应用领域：

LifeSensors的荧光标记TUBE技术在检测PROTAC、分子胶及其他调控剂介导的E3连接酶底物泛素化中的应用价值，说明该新型检测方法可用于高通量筛选能诱导目标蛋白泛素化的PROTAC、分子胶，为药物研发提供成熟的技术框架，并且有该试剂盒售卖。

2.具体原理如下：

 图1.基于TUBE1(Alexa647)的底物蛋白泛素化TR-FRET检测技术

(1) 体系构建：在384孔板的体外泛素化反应体系中，加入生物素标记的底物蛋白、E3连接酶、PROTAC/分子胶、TUBE1(Alexa647)、链霉亲和素-铕(Streptavidin-Europium)。

(2) 分子识别：TUBE（串联泛素结合实体）对泛素链有亚纳摩尔级高亲和力，当底物蛋被泛素化形成多聚泛素链后，TUBE1(Alexa647)会特异性结合到底物蛋白的多聚泛素链上。

链霉亲和素-铕 (Streptavidin-Europium) 通过链霉亲和素与底物蛋白上的生物素标签特异性结合。

(3) 信号生成机制：若底物蛋白发生泛素化修饰，结合了泛素链的TUBE1(Alexa647)会和结合底物的链霉亲和素-铕距离足够近，满足荧光共振能量转移的条件：铕作为供体发出的荧光会激发作为受体的AlexaFluor@647产生可检测的TR-FRET信号；若底物未被泛素化，两种荧光基团距离过远，无法产生有效信号。最终检测到的信号强度与底物的泛素化水平正相关

三、技术应用案例：PROTAC介导的KRAS G12C的泛素化检测

1.应用背景

KRAS是经典致癌基因，其中KRAS G12C突变是非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的重要驱动因素，目前已有靶向KRAS G12C的药物获批，但耐药性、肿瘤穿透性不足的问题促使研究者开发可降解KRAS的新型PROTAC分子、分子胶，而此前缺乏适用于筛选该类化合物的体外泛素化检测方法。

2.检测技术原理（TR-FRET方法）

 图2 基于TUBE1(Alexa647)的底物蛋白(Kras G12C) 泛素化TR-FRET检测技术

(1) 体系组成：使用TUBE1(Alexa647)（TUBE1共价标记TUBE1(Alexa647)7荧光染料）作为泛素链识别工具。反应体系包含生物素标记的KRAS G12C、VHL (E3连接酶)、PROTAC分子(LC2分子)、TUBE1(Alexa647)、链霉亲和素-铕(Streptavidin-Europium)。

(2) 信号生成：若PROTAC (LC2分子)介导的KRAS G12C被VHL (E3) 泛素化，TUBE1(Alexa647)会结合底物上的多聚泛素链，链霉亲和素-铕(Streptavidin-Europium)会结合底物的生物素标签，两种荧光基团距离接近后发生荧光共振能量转移，产生可检测的TR-FRET信号，信号强度与底物蛋白(KRAS G12C) 泛素化水平正相关。

(3). 实验验证结果

图3. VHL KRASG12C仅在LC2 PROTAC 存在时发生泛素化。泛素化水平采用LifeSensor公司的含TUBE(Alexa647)的 TR-FRET检测试剂盒进行测定。

结果显示(如图3）：

验证反应特异性：仅在PROTAC (LC2分子) 存在的情况下，VHL E3连接酶才会催化KRAS G12C发生泛素化，证明该泛素化过程严格依赖PROTAC（即LC2分子）的连接作用。

剂量效应特征：LC2分子介导的KRAS G12C泛素化水平呈现典型的剂量依赖性变化：随着LC2分子的浓度升高，泛素化信号先上升至峰值（Ubmax），之后在更高浓度下信号下降，符合PROTAC反应特有的“钩效应”（高浓度下PROTAC分别单独结合E3和底物，无法形成三元复合物，导致泛素化效率降低）。

方法准确性验证：实验测得LC2分子介导KRAS G12C泛素化的峰值浓度在0.037μM到0.1μM之间，与已发表的研究数据高度吻合，验证了该TUBE1(Alexa 647)在TR-FRET检测体系的准确性和可靠性[2-3]。

实验体系稳定性：同时加入阴性、阳性对照组数据方差低、信号背景比优异，说明该检测体系稳定可靠，可用于后续PROTAC化合物的活性定量评估。

图4.Kinetics of VHL and PROTAC (12nM, LC2) mediated KRASG12C ubiquitination measured using LifeSensor’s TUBE1（Alexa647）based Ubiquant TR-FRET assay kit.

图4 结果证明：PROTAC (LC2分子，浓度为 12 nM）分子的介导下，VHL（E 3 Ligase) 催化KRAS G12C泛素化的动力学过程，通过TR-FRET信号随时间的变化，直观展示了泛素化反应的动态进程，可用于分析该反应的速率、达到平台期的时间等动力学参数，为实验反应时长的选择、化合物作用快慢的评估提供量化依据。

参考文献：

[1] https://lifesensors.com/

[2] Bond MJ, Chu L, Nalawansha DA, Li K, Crews CM. Targeted Degradation of Oncogenic KRASG12C by VHL-Recruiting PROTACs. ACS Cent Sci. 2020 Aug 26;6(8):1367-1375. doi: 10.1021/acscentsci.0c00411.

[3] Taoling Zeng et al., (2024). Targeting oncogenic K-Ras mutants with a small-molecule degrader through Nedd4-1.bioRxiv, https://doi.org/10.1101/2024.04.26.591418.

四、TUBEs产品系列

LifeSensors提供4种不同特异性的荧光标记TUBE产品，可实现全局多聚泛素化检测及链特异性泛素化分析，均相检测的特性相比ELISA技术更具优势。

LifeSensors 成立于1996年，位于美国宾夕法尼亚州费城，是一家为药物发现与研究提供方法和可行性技术方法的生物技术公司。公司致力于为泛素和泛素蛋白酶体通路研究领域提供高品质的抗体、酶、蛋白质等试剂和试剂盒，产品最全、最新，是泛素研究者的最佳选择。其原核和真核蛋白表达系统SUMOpro和SUMOstar已被世界范围内的学术、政府研究机构和制药、生物技术公司广泛应用。通过提供创新的研究工具，LifeSensors已成为泛素和泛素样蛋白途径的领导者。